于富洋， 楊勝昌， 郭亞凈， 趙亞碩， 劉思文， 吉恩生

(河北中醫(yī)學(xué)院， 石家莊 050200)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)表現(xiàn)為睡眠期間的反復(fù)發(fā)作的咽部阻塞，慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是其典型的病理生理特征[1, 2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，OSA可以增加高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、腦卒中等疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。包括腸系膜動(dòng)脈在內(nèi)的機(jī)體微血管對組織器官的血流供應(yīng)及血壓的維持具有至關(guān)重要的作用，微血管結(jié)構(gòu)功能障礙是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病變基礎(chǔ)，而CIH對微血管系統(tǒng)的影響尚不完全明確[6, 7]。CIH可以直接或間接的損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞障礙[8]。這被認(rèn)為是CIH誘導(dǎo)的一系列心腦血管疾病的重要致病因素，其機(jī)制主要與內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低有關(guān)。本課題組先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，35 d的CIH暴露可以引起大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，舒張功能減弱[9]。臨床研究中，OSA患者也表現(xiàn)出顯著降低的乙酰膽堿及緩激肽誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)[10, 11]。本研究旨在觀察CIH對大鼠腸系膜動(dòng)脈結(jié)構(gòu)功能的損傷并探究其可能的機(jī)制。

目前關(guān)于OSA患者的治療方法主要有持續(xù)正壓通氣、口腔矯治器、手術(shù)治療及并發(fā)癥的針對治療等，但都存在治療反復(fù)及依從性差的問題。消痰化瘀利竅方是根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，能夠有效改善OSA患者癥狀及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究通過建立CIH大鼠模型，探討消痰化瘀利竅方對CIH誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈功能損傷的保護(hù)作用，為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對OSA及其并發(fā)癥的臨床治療提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理

48只雄性SD大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重(240±20)g，隨機(jī)平均分成四組：常氧對照組(Normoxia)，慢性間歇性低氧組(CIH)、慢性間歇性低氧中藥干預(yù)組(Formula+CIH)、中藥對照組(Formula)。

大鼠正常適應(yīng)一周后，開始造模。在動(dòng)物正常休息的白天進(jìn)行造模，將CIH及Formula+CIH組暴露于動(dòng)物慢性間歇性低氧裝置，前1.5 min向艙內(nèi)充入100%氮?dú)馐筄2濃度降至9%，后1.5 min充入醫(yī)用氧(>99.5%)使O2濃度升至21%，每一循環(huán)3 min，每天8:00 am～4:00 pm上艙8 h，共21 d。Normoxia及Formula組大鼠置于低氧艙內(nèi)，但向艙內(nèi)充入空氣。同時(shí)，每天上艙前Formula+CIH與Formula組給予消痰化瘀利竅方灌胃(生藥量24 g/kg,以中藥藥理研究方法學(xué)的大鼠與人藥物劑量折算方法折算臨床劑量)，CIH與Normoxia組灌服同等體積生理鹽水，直至造模結(jié)束。

1.2 主要試劑與儀器

消痰化瘀利竅方由丹參30 g，法半夏12 g，陳皮10 g，茯苓15 g，生黃芪15 g，炒白術(shù)12 g，石菖蒲12 g，郁金12 g，射干12 g，白芥子10 g，桔梗12 g，枳殼15 g，川芎12 g，赤芍15 g，地龍12 g組成，中藥材購自于神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，以水煮醇沉法制備,制成含生藥2.4 g/ml制劑，；苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)均購自Sigma；動(dòng)物間歇性低氧裝置(Oxycycler Model A84BioSpherix)；DMT微血管張力測定裝置( Danish Myo Technology A/S)、PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。

1.3 腸系膜動(dòng)脈舒張功能測定

各組大鼠用25%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉，隨后腹部切口，暴露并分離腸系膜二級動(dòng)脈。截?cái)鄤?dòng)脈后，立即放入提前充氧預(yù)冷(4℃)的K-H液(mmol/L,NaCl 118.3, NaHCO325, KCl 4.7, KH2PO41.2, MgSO41.2, glucose 11.1，CaCl21.8)中。在體式顯微鏡下，將動(dòng)脈截成約2 mm的血管環(huán)并用金屬絲穿過，固定于充滿K-H液的恒溫浴槽中，充入95%O2和5%CO2的混合氣，平衡45 min。

血管環(huán)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，調(diào)至最適前負(fù)荷，并用高鉀溶液(mmol/L,NaCl 52.5, KCl 44.7, MgCl21.2, CaCl22.8, Glucose 20, HEPES 11.9, pH=7.40)激活血管環(huán)以檢查其活性。PE(10-5mol/L)預(yù)收縮，再用Ach(10-5mol/L)舒張血管檢查內(nèi)皮完整性，認(rèn)定舒張大于75%的血管環(huán)為內(nèi)皮完整[12]。

在給予PE(10-5mol/L)預(yù)收縮后，分別累積加入終濃度為10-8mol/L、3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L、3×10-6mol/L、10-5mol/L的ACh及L-Arg，繪制量效曲線，觀察舒張變化。

1.4 血清中NO水平測定

各組大鼠在造模前1 d與造模第21日，乙醚麻醉，目內(nèi)眥取血。樣本室溫靜置30 min后離心 (4 500 r/min,15 min,4℃),取上清，-80℃冰箱保存并按試劑盒說明書采用硝酸還原酶法測定NO含量。

1.5 組織病理學(xué)觀察

分離腸系膜二級動(dòng)脈并用4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 Western blot檢測eNOS、p-eNOS的表達(dá)

取腸系膜動(dòng)脈，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，超聲破碎后，離心(12 000 r/min,15 min,4℃)取上清，BCA測定蛋白濃度。50 μg蛋白加入2.5 μl的sample buffer,振蕩均勻,100℃水浴5 min變形， -80℃保存待用。電泳(80 V，40 min；160 V，90 min)結(jié)束后，進(jìn)行濕轉(zhuǎn)(300 mA,90 min)。按Maker裁剪相應(yīng)目的蛋白的條帶，5%脫脂牛奶封閉90 min,TBST清洗三次，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST清洗三次，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)孵育90 min。TBST清洗三次后，應(yīng)用ECL發(fā)光顯色并拍照。采用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析，以p-eNOS/eNOS灰度值表示eNOS磷酸化水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 消痰化瘀利竅方對CIH大鼠腸系膜動(dòng)脈組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，Normoxia組大鼠的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，形狀規(guī)則。與Normoxia組相比，CIH組腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞水腫、脫落，中膜明顯增厚。消痰化瘀利竅方干預(yù)能明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞的病理改變及中膜增厚(圖1)。與Normoxia組相比，單獨(dú)給予消痰化瘀利竅方未引起大鼠腸系膜動(dòng)脈明顯的組織病理學(xué)的變化。

Fig.1CIH-induced pathological examination of mesenteric artery was detected by HE staining(×400)

A: Normoxia group; B: CIH group; C: Formula+CIH group; D: Formula group

2.2 消痰化瘀利竅方對Ach與L-Arg誘導(dǎo)的CIH大鼠腸系膜動(dòng)脈舒張功能的影響

在10-5mol/L的PE誘發(fā)最大收縮程度后，分別按濃度梯度依次加入Ach、L-Arg，誘導(dǎo)出各組的最大舒張反應(yīng)(表1)。與Normoxia組相比，CIH組大鼠腸系膜動(dòng)脈舒張功能明顯受損。與CIH組相比，消痰化瘀利竅方干預(yù)組大鼠的腸系膜動(dòng)脈舒張功能得到改善。Formula組與Normoxia組比較，腸系膜舒張功能未表現(xiàn)出顯著差異(圖2)。

GroupACh(% of Emax)L-Arg(% of Emax)Normoxia15.6±1.616.9±2.0CIH33.1±2.5##38.5±1.5##Formula+CIH22.1±1.6**23.4±1.9**Formula16.1±1.617.3±1.1

Ach: Acetylcholine ; L-Arg: L-arginine;

Emax: Maximum responses

**P<0.01vsNormaxia group;##P<0.01vsCIH group

Fig.2Effect of Xiaotan Huayu Liqiao formula on relaxation of mesenteric arteryinduced by ACh and L-Arg in the rats exposed to CIH

*P<0.05,**P<0.01vsNormaxia group;#P<0.05,##P<0.01vsCIH group

2.3 消痰化瘀利竅方對血清中NO水平的影響

各組大鼠血清中NO水平按ΔNO(CIH暴露：21 d～0 d)做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，與Normoxia組相比，CIH組大鼠21 d血清NO的水平顯著降低(P< 0.01)。消痰化瘀利竅方干預(yù)能夠明顯提高CIH引起的血清NO水平的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。單獨(dú)給予消痰化瘀利竅方大鼠血清中NO水平與Normoxia組沒有表現(xiàn)出顯著差異。

**P<0.01vsnormaxia group;##P<0.01vsCIH group

2.4 消痰化瘀利竅方對CIH大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS磷酸化水平的影響

本研究以Western blot法測定各組eNOS、p-eNOS表達(dá)水平(圖3)，以p-eNOS/eNOS比值反映大鼠腸系膜動(dòng)脈eNOS的磷酸化水平，Normoxia組p-eNOS/eNOS比值為(98.5±9.1)%。與Normoxia組相比，CIH組大鼠p-eNOS/eNOS比值顯著降低為(60.5±5.5)%(P<0.01)。Formula+CIH組與CIH組大鼠相比，p-eNOS/eNOS比值明顯升高為(86.8±9.6)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Normoxia組相比，F(xiàn)ormula組p-eNOS/eNOS比值無明顯差異為(112.5±10.4)%。

Fig.3Effects of Xiaotan Huayu Liqiao formula on the ratio of p-eNOS/eNOS in mesenteric artery of rats

p-eNOS: Phosphorylated endothelial NO synthase; eNOS: Endothelial NO synthase

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)引起的慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)被認(rèn)為是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4, 13],其致病因素與內(nèi)皮功能障礙及血管重構(gòu)密切相關(guān)[14]。研究證明，CIH可以直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管舒張、收縮因子分泌紊亂，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[15]。Saletu等發(fā)現(xiàn)，OSA患者表現(xiàn)出顯著增加的頸動(dòng)脈內(nèi)膜與中膜厚度，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，21 d的CIH暴露引起大鼠主動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯的病理學(xué)損傷及中膜增厚[17, 18]。腸系膜動(dòng)脈的分支屬于微血管系統(tǒng)，對機(jī)體血壓的維持與組織器官的血流供應(yīng)具有至關(guān)重要的作用[7]。本研究通過建立CIH大鼠模型并觀察其腸系膜動(dòng)脈形態(tài)學(xué)及功能的改變，發(fā)現(xiàn)CIH引起大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的水腫、脫落以及平滑肌明顯增厚，顯著降低腸系膜動(dòng)脈的舒張能力。微血管的損傷應(yīng)屬中醫(yī)中的瘀血范疇。楊玉萍等認(rèn)為氣滯血瘀是OSA合并心腦血管疾病的關(guān)鍵病因病機(jī)，瘀血既為病理因素，也是致病因素[19]。消痰化瘀利竅方是多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、豁痰通竅的功效。對于改善間歇性低氧引起的微血管的瘀血證可謂恰合病機(jī)。本研究結(jié)果表明，消痰化瘀利竅方能夠顯著改善CIH引起的大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞增殖以及降低的腸系膜動(dòng)脈舒張能力，且單獨(dú)應(yīng)用消痰化瘀利竅方對常氧大鼠未產(chǎn)生明顯影響。

NO作為最主要的內(nèi)皮舒張因子通過調(diào)節(jié)血管張力與內(nèi)皮功能在心腦血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[20]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase, eNOS)是內(nèi)皮細(xì)胞中主要表達(dá)的NO同工酶，通過磷酸化調(diào)節(jié)NO的生成釋放[21]。慢性低氧可使eNOS脫偶聯(lián)減少NO的產(chǎn)生而降低NO的生物利用度，導(dǎo)致肺血管舒張功能障礙及平滑肌細(xì)胞增殖[22]。OSA引起的內(nèi)皮功能障礙也與eNOS的活化水平密切相關(guān)[23]。本實(shí)驗(yàn)室早期研究發(fā)現(xiàn)CIH暴露顯著降低大鼠血清中NO水平及Ach誘導(dǎo)的主動(dòng)脈舒張反應(yīng)[9]。Hong等的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，CIH暴露能夠使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的磷酸化水平顯著降低[24]。Manuel等在CIH暴露14 d的大鼠門靜脈中也觀察到eNOS活性的降低[25]。本研究結(jié)果顯示，消痰化瘀利竅方能夠顯著提高CIH大鼠腸系膜動(dòng)脈對Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)的損傷，提高血清NO含量，上調(diào)eNOS磷酸化水平。以上提示，消痰化瘀利竅方可以通過促進(jìn)eNOS活化從而提高NO水平來改善腸系膜動(dòng)脈的內(nèi)皮功能障礙。

NO的底物L(fēng)-精氨酸(L-arginine, L-Arg)可以在NOS的介導(dǎo)下生成NO，而精氨酸酶(L-arginase)能夠?qū)-Arg水解為鳥氨酸與尿素，是內(nèi)皮細(xì)胞中L-Arg的主要消耗途徑[26, 27]。有研究提出，L-arginase水平的改變也參與到血管內(nèi)皮功能障礙的形成當(dāng)中。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性抑制L-arginase可以提高離體血管環(huán)NO依賴的舒張反應(yīng)[28, 29]。Krause等的研究發(fā)現(xiàn)，CIH暴露21 d上調(diào)大鼠頸外動(dòng)脈Arginase-1的表達(dá)[14]。本研究顯示，消痰化瘀利竅方干預(yù)能改善CIH引起的大鼠腸系膜動(dòng)脈L-Arg誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)下降，提示其改善腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制可能與降低L-arginase水平有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CIH能夠損傷大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，引起舒張功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致可能的心腦血管損傷。消痰化瘀利竅方可以通過激活腸系膜動(dòng)脈eNOS,降低L-arginase水平，從而提高NO生物利用率，有效改善腸系膜動(dòng)脈結(jié)構(gòu)功能的損傷，為OSA誘導(dǎo)的心腦血管并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。