李亞萍 周孟祺 李穩(wěn) 程惠敏 謝先芝

摘要：水稻光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明，phyB在調節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及非生物脅迫反應中具有重要作用，但是phyB對水稻苗期株高和生物量的影響仍未有報道。本研究比較了野生型和phyB突變體（phyB1和phyB2）在不同培養(yǎng)條件下苗期的株高、鮮重和干重，結果表明，在營養(yǎng)液和基質培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，鮮重和干重與野生型差異并不明顯，據(jù)此推測，phyB調控水稻苗期株高，但對生物量的影響不明顯。利用基因芯片技術，比較了野生型和phyB突變體苗期地上部分的基因表達圖譜，篩選到受phyB上調的基因115個，受phyB下調的基因95個;差異基因的GO富集分析結果表明，富集的基因主要參與水稻生長等生物學功能，因此推測通過調控這類基因的表達而影響苗期生長。本研究首次揭示了phyB對水稻苗期株高和生物量的影響，并進一步討論了phyB在選育機插秧水稻品種中的潛在應用價值。

關鍵詞：水稻;光敏色素B;苗期;生物量;株高

中圖分類號：S511文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0013-06

光不僅為植物的光合作用提供能量，而且作為一種信號影響植物的生長發(fā)育。光敏色素（phytochrome）是植物體內的一種重要光受體，主要感受紅光和遠紅光，在植物從種子萌發(fā)到成熟的整個生長發(fā)育過程中起到重要的調節(jié)作用[1，2]。水稻光敏色素基因家族包括3個成員：PHYA、PHYB和PHYC[3，4]。Takano等的研究表明水稻phyB通過感受紅光可以調節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及育性等[5]。而且，phyB還影響水稻的耐寒性和耐旱性[6，7]。

除了對形態(tài)建成和脅迫反應的調控，水稻光敏色素也參與調控碳代謝。有報道表明，水稻phyAphyBphyC三突變體白天的糖含量，特別是新葉中的還原糖、葡萄糖、果糖和半乳糖含量顯著高于野生型;黑暗條件下，水稻phyAphyBphyC三突變體中的淀粉含量高于野生型，表明光敏色素影響黑暗中淀粉的利用[8]。此外，光敏色素還影響三羧酸循環(huán)組分的含量[8，9]。在其它植物中的研究也表明，光敏色素介導的光信號與碳代謝及植物生長可塑性密切相關[10]。植物碳代謝主要包括光合作用驅動的糖類合成代謝及呼吸作用介導的糖類分解代謝。碳代謝所產生的淀粉是植物體內碳的主要儲存形式，是構成植物生物量的基本組分之一[11]。據(jù)此推測光敏色素影響水稻的生物量。

為了解析PHYB基因對水稻苗期株高和生物量的影響，本研究比較了野生型和phyB突變體水稻在不同生長條件下的干重、鮮重和株高等特性，并利用基因芯片技術分析了phyB突變體的基因表達譜，以進一步討論phyB突變體苗期的這種生長發(fā)育和代謝特征在水稻機插秧品種改良中的潛在應用價值。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用水稻材料共3個，分別是日本晴（WT）及其phyB1和phyB2突變體。phyB1和phyB2突變體為日本晴經γ-射線輻射誘變獲得，具體遺傳背景見文獻[5]。

1.2營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子用70%乙醇表面消毒1min、5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20min后，無菌水沖洗4～5次;置于28℃誘導萌發(fā)3d，然后播種于96孔板（底部去掉），轉移至Yoshida溶液中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光溫條件是光期14h、28℃、7900lx，暗期10h、24℃。分別在Yoshida溶液中培養(yǎng)10、15、20、25d時測量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計算phyB1和phyB2突變體的相對高度。每兩天更換一次溶液。每個材料測量至少20株。

每5株作為1組測量整株鮮重，然后在105℃殺青30min，80℃烘6d至恒重。利用分析天平稱量干、鮮重。

1.3基質培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子消毒后在28℃誘導萌發(fā)4d。挑選萌發(fā)一致的種子播種到基質（濟南魯青育苗基質）中，在濟南飲馬泉試驗農場（36°40′N，117°00′E）的網室中培養(yǎng)（2017年6—7月，自然生長條件）。分別于培養(yǎng)10、15、20、25d時測量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計算phyB1和phyB2突變體的相對高度。每個材料測量至少30株。

干重和鮮重的測量如上所述。

1.4基因芯片分析

對營養(yǎng)基質中生長至三葉期的野生型、phyB1和phyB2突變體地上部分進行取材，利用RNeasyPlantMiniKit（QIAGEN）提取RNA，然后利用22KOligo-microarray（AgilentTechnologies，USA）進行基因芯片分析，具體方法參考文獻[12]。選擇在野生型和phyB突變體中表達水平差異2倍的基因作為差異表達基因，并利用AgriGOv2.0在線軟件對差異基因進行GO富集分析。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

采用MicrosoftExcel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與做圖。

2結果與分析

2.1營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

在營養(yǎng)液中生長不同時間后，野生型的株高均顯著高于phyB1和phyB2突變體，且各時期phyB突變體相對于野生型的株高基本不變，均在73%～80%之間（圖1）。表明，PHYB基因功能缺失導致株高降低。

有研究表明，光敏色素介導的光信號與碳代謝和植物生長可塑性密切相關[10]。因此，我們進一步比較了野生型和phyB突變體的干重和鮮重。在萌發(fā)后10d時，phyB突變體的鮮重顯著高于野生型，干重僅phyB2差異顯著;在萌發(fā)后15d和20d時，野生型和phyB突變體的鮮重和干重均無顯著差異;但在萌發(fā)后25d時，phyB1和phyB2突變體苗期的鮮重和干重均顯著低于野生型（圖2），這可能是由于營養(yǎng)液培養(yǎng)后期材料密度太大，導致生長不正常。上述結果表明，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.2基質培養(yǎng)的野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

為了模擬大田生長情況，我們比較了野生型、phyB1和phyB2突變體在營養(yǎng)基質中培養(yǎng)不同時期的株高、鮮重和干重。在萌發(fā)后不同天數(shù)，野生型的株高均高于phyB1和phyB2突變體，但是隨著發(fā)育進程，株高的差別逐漸縮小（圖3）。如在營養(yǎng)基質中培養(yǎng)15d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的75.3%和74.2%;在營養(yǎng)基質中培養(yǎng)20d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的82.9%和82.0%;在營養(yǎng)基質中培養(yǎng)25d時，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的97.3%和95.7%。

我們進一步比較了野生型和phyB突變體的鮮重和干重。在營養(yǎng)基質中生長10d時，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著高于野生型;但生長15d時，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著低于野生型;生長20d和25d時，除25d時phyB1的干重顯著高于野生型外，野生型和phyB突變體的鮮重和干重無顯著差異（圖4）。表明，在自然光照下，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.3phyB調控的基因表達圖譜

上述結果表明，野生型和phyB突變體之間苗期株高存在明顯差異。此外，野生型和phyB突變體葉角和葉綠素含量也顯著不同[5，13]。為了揭示phyB調控水稻苗期生長發(fā)育的分子機制，我們比較了野生型和phyB突變體之間的基因表達圖譜。結果顯示，野生型和phyB突變體之間的差異表達基因210個，其中受phyB上調（即在WT中表達水平高于phyB突變體的2倍以上）的差異表達基因115個，受phyB下調（即在WT中表達水平低于phyB突變體的2倍以上）的差異表達基因95個。利用AgriGOv2.0在線軟件對差異表達基因進行GO富集分析，結果表明，受phyB上調的差異表達基因主要參與生長（GO：0040007：growth）、外部刺激應答（GO：0009605：responsetoexternalstimulus）和蛋白磷酸化（GO：0006468：proteinphosphorylation）等生物學過程（圖5）;受phyB下調的差異表達基因主要參與生長（GO：0040007：growth）、系統(tǒng)發(fā)育（GO：0048731：systemdevelopment）和生殖過程（GO：0022414：reproductiveprocess）等生物學功能（圖6）。不管在上調基因還是下調基因中，富集的基因均與水稻生長生物學過程（GO：0040007：growth）有關，推測phyB通過調控這類基因的表達而影響水稻苗期株高。

3討論與結論

本研究比較了野生型和phyB突變體苗期株高和生物量（干重和鮮重），結果顯示，在兩種培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，這表明phyB影響水稻苗期株高。利用基因芯片篩選到受phyB上調的差異表達基因115個，受phyB下調的差異表達基因95個;差異基因GO富集分析結果表明，最富集的一類基因主要參與生長生物學過程，這可能與phyB突變體水稻株高、葉角等苗期生長發(fā)育特征有關。

在營養(yǎng)基質培養(yǎng)中（自然光照條件下），phyB突變體的相對株高大于營養(yǎng)培養(yǎng)條件下的相對株高?？紤]到Yoshida溶液中含有水稻生長所需要的各種營養(yǎng)元素，我們推測，在不同培養(yǎng)條件下株高上的差異主要是由于光照強度或者光質導致的。PHYB編碼光敏色素蛋白質，主要感受紅光，因此環(huán)境中的光質必定會影響光敏色素突變體的生長發(fā)育。此外，植物體內的其他光受體如主要感受藍光的隱花色素和向光素，以及主要感受紫外光的受體UVR8也能調節(jié)植物的生長發(fā)育。因此有一種可能性是自然光中具有更廣的光譜，誘發(fā)了其他光受體的作用，彌補了phyB缺失所引起的株高損失。值得注意的是，在兩種生長條件下，phyB突變體和野生型之間的鮮重和干重差異不顯著，推測phyB不影響水稻苗期的生物量。

水稻是我國播種面積最大、總產量最多的糧食作物，是我國65%左右人口的主食，在糧食生產和消費中處于主導地位。傳統(tǒng)水稻種植通常經過播種、育秧、插秧等多個步驟，用工多，耗時長。近幾年隨著農村勞動力外出務工的增多，我國水稻生產用工矛盾越來越突出。機插秧是用插秧機高效插秧代替原始手插的高產栽培技術，徹底解除了人工插秧的繁重勞動。然而機插秧對秧苗高度和秧苗質量要求很高，其中秧齡彈性是研究的核心，只有具有較大秧齡彈性范圍，才能使機插水稻的推廣和應用具有更強的實用性和可操作性。如果水稻品種秧苗期株高較低，可以提高秧齡彈性，有利于機插秧的推廣。然而目前水稻矮化品種在整個水稻生育期都表現(xiàn)矮化，導致生物量和產量降低。因此需要培育在秧苗期株高較低，成株期生長勢較強的水稻品種。本研究中基質生長試驗基本模擬了水稻育苗階段的生長情況，種子萌發(fā)后在基質中生長的1個月內，phyB突變體的株高低于野生型，而干重和鮮重差別不大，而且在生長后期，phyB突變體株高與野生型株高的差異逐漸縮小。phyB突變體的這種生長特征可能更適合于機插秧栽培方式。因此PHYB基因可以作為一個培育機插秧水稻品種的潛在改良位點。

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