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        柑桔胚乳培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

        2019-07-02 01:19:46李海林聶振朋柯甫志
        現(xiàn)代園藝·綜合版 2019年7期
        關(guān)鍵詞:胚乳正交試驗(yàn)柑桔

        李海林 聶振朋 柯甫志

        摘要:利用Minitab軟件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(33),以Ms培養(yǎng)基,分別加入不同質(zhì)量濃度的6-BA.2,4-D、對(duì)柑桔胚乳愈傷組織誘導(dǎo);以Ms培養(yǎng)基,分別加入不同質(zhì)量濃度TDZ和NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽。結(jié)果表明:柑桔愈傷組織誘導(dǎo)最佳組合為6-BA1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)30%;柑桔不定芽誘導(dǎo)最佳組合為T(mén)DZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose40g/L,不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)35%。

        關(guān)鍵詞:柑桔;胚乳;正交試驗(yàn)

        我國(guó)是柑桔的重要原產(chǎn)地之一,柑桔資源豐富,優(yōu)良品種繁多,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培、選擇,柑桔成了人類(lèi)的珍貴果品。柑桔果實(shí)既可鮮食,又可加工成果汁,深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。我國(guó)柑桔品種資源雖然豐富,但栽培的品種多是有核甚至多核的,因而影響了商品價(jià)值和在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力Ⅲ。

        無(wú)核柑桔果實(shí)以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良而倍受人們的青睞,其無(wú)論在鮮食和加工上都具有重要意義。無(wú)核柑桔,育種上指平均單果種子數(shù)在3粒以下,在商業(yè)上指平均單果種子數(shù)在5粒以下。柑桔無(wú)核果有很多是天然形成的,但大部分無(wú)核品種是人為選育出來(lái)的。胚乳是雙受精產(chǎn)物之一,由1個(gè)精核和2個(gè)極核融合而成,是三倍體組織,由胚乳再生的植株通常也是三倍體,可產(chǎn)生無(wú)子果實(shí)。通過(guò)胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株,技術(shù)要求不高,三倍體得率高,嵌合體少,育種周期短,柑桔胚乳的離體培養(yǎng)是獲得三倍體無(wú)籽柑桔的重要途徑。通過(guò)研究柑桔胚乳三倍體植株的誘導(dǎo),以期獲得無(wú)核的三倍體胚乳再生植株。

        1材料與方法

        1.1試驗(yàn)材料

        柑桔果實(shí)取自臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院果園,以果齡2個(gè)月左右的柑桔幼果為宜。

        1.2試驗(yàn)方法

        1.2.1幼果處理。將新鮮果實(shí),用70%乙醇浸泡30s,再用0.1%HgCI2溶液浸泡6~7min,然后用無(wú)菌水沖洗3-4次,每次3~5min。再用干燥的無(wú)菌濾紙吸干種子表面的水分后,然后將果實(shí)放在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)。

        1.2.2取胚乳。用流水沖洗預(yù)處理后的柑桔幼果30min左右,剝離出種子,將種子用0.1%HgCl2消毒6~7min。再用無(wú)菌水沖洗4~5次,每次3~5min。在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下,在種子的合點(diǎn)端縱剖1刀,打開(kāi)種子取出胚囊。輕輕擠壓胚囊的胚端,擠出幼胚,剝離出胚乳,選擇半透明狀固體、富有彈性的胚乳,單獨(dú)接種。

        1.2.3愈傷組織誘導(dǎo)。所用培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,對(duì)6-BA、2,4-D、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。正交設(shè)計(jì)的因素及水平分別為6-BA濃度(0.5、1.0、1.5mg/L),2,4-D濃度(0-2、0.4、0.6mg/L),sucrose(20、40、60g/L)(見(jiàn)表1)。每個(gè)處理接種10瓶。及時(shí)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察,50~60d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織塊數(shù)/接種個(gè)數(shù)。

        1.2.4不定芽誘導(dǎo)。獲得胚乳愈傷組織增殖培養(yǎng)后,接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,對(duì)TDZ、NAA、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。正交設(shè)計(jì)的因素及水平分別為T(mén)DZ濃度(0.5、1.0、1.5mg/L),NAA濃度(0.1、0.2、0.3mg/L),sucrose(20、40、60g/L)(見(jiàn)表2)。每處理每次接種20塊愈傷組織。不定時(shí)觀察愈傷組織動(dòng)態(tài)變化,50~60d后統(tǒng)計(jì)不定芽發(fā)生情況。

        1.2.5組培苗倍性鑒定。將不定芽接種于MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2-3周成苗。利用流式細(xì)胞儀對(duì)組培苗倍性進(jìn)行鑒定。鑒定方法參照陳城報(bào)道的方法。

        培養(yǎng)基pH值5.8-6.2。培養(yǎng)條件均為:溫度25°C,光照時(shí)間為12h/d,光照強(qiáng)度為2000Lx,瓊脂0.7%,活性炭濃度1.0mg/L。

        2結(jié)果與分析

        2.1愈傷組織誘導(dǎo)

        由表4可知,3種因子對(duì)柑桔愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的大小依次為6-BA>2,4-D>sucrose。說(shuō)明同種類(lèi)培養(yǎng)基中,不同濃度的6-BA對(duì)柑桔愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大,2,4-D次之,而sucrose的影響較小。鑒于以上分析,結(jié)合表3可知:柑桔愈傷組織誘導(dǎo)最佳組合為A2B1C2,也就是蔗糖6-BA 1.0mg/L+2,4-D0.2mg/L+sucmse 40g/L,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)30%。

        2.2不定芽誘導(dǎo)

        由表6可知,3種因子對(duì)不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)的大小依次為T(mén)DZ>NA>sucrose。說(shuō)明同種類(lèi)培養(yǎng)基中,不同濃度的TDZ對(duì)柑桔愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大,NAA次之,而sucrose的影響較小。鑒于以上分析,結(jié)合表5可知:柑桔不定芽誘導(dǎo)最佳組合為A1B1C2,也就是TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L,不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)35%。

        2.3植株形成與鑒定

        不定芽在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2~3周形成再生植株。鑒定結(jié)果如圖1。

        3結(jié)論

        Gmitter及趙詠望等早在20世紀(jì)90年代就從甜橙品種的胚乳中誘導(dǎo)出了三倍體植株。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì),研究不同激素的種類(lèi)、濃度及其配比對(duì)柑桔組織培養(yǎng)的影響,與傳統(tǒng)試驗(yàn)相比,本試驗(yàn)?zāi)苋菁{更多的因素和水平,大大減少了試驗(yàn)次數(shù),提高準(zhǔn)確率。利用流式細(xì)胞儀鑒定植物染色體的倍性,不受植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和環(huán)境條件的影響,取材部位可以是根、莖、葉片、花、果實(shí)、種子等器官,具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)。已經(jīng)成功應(yīng)用于果樹(shù)、蔬菜、花卉等植物的倍性鑒定中。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同的激素配比對(duì)柑桔胚乳愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)有很大的影響。本試驗(yàn)中柑桔愈傷組織誘導(dǎo)最佳組合為:6-BA1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)30%;柑桔不定芽誘導(dǎo)最佳組合為:TDZ0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L,不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)35%。

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