呂 幸，吳維青，崔英霞，陳芳芳，孫 寧，姚新月，夏正坤，劉志紅，李曉軍

0 引 言

Alport綜合征（Alport Syndrome，AS）作為常見(jiàn)的遺傳性腎小球疾病，臨床主要表現(xiàn)為血尿伴或不伴蛋白尿和進(jìn)行性腎功能衰竭，部分患者還患有感音神經(jīng)性耳聾或眼部異常［1-2］。AS由于編碼Ⅳ型膠原α鏈的基因——COL4A5、COL4A4、COL4A3發(fā)生突變引起，根據(jù)遺傳方式的不同可以分為X連鎖顯性遺傳Alport綜合征（XLAS，OMIM no.301050），常染色體隱性遺傳Alport綜合征（ARAS OMIM no.104200）以及常染色體顯性遺傳Alport綜合征（ADAS OMIM no.203780）［3-4］。COL4A5 基因突變?cè)斐傻?XLAS 是最常見(jiàn)的Alport綜合征，約占總發(fā)病率的85%［5-6］。

目前超過(guò)1168種COL4A5基因突變已被發(fā)現(xiàn)，其中剪接突變約占20%［7］。研究認(rèn)為，實(shí)際的剪接突變遠(yuǎn)不止如此，大多數(shù)已報(bào)道的突變未在RNA水平進(jìn)行分析，一些錯(cuò)義突變、無(wú)義突變，甚至同義突變也可能影響pre-mRNA的剪接過(guò)程［8-10］。對(duì)AS患者的可疑基因變異進(jìn)行功能性分析有助于闡明其發(fā)病的分子機(jī)制。

本研究通過(guò)目標(biāo)序列捕獲聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)一個(gè)中國(guó)Alport家系進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的COL4A5基因突變，體外Minigene實(shí)驗(yàn)證明此突變影響pre-mRNA的剪接過(guò)程。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象先證者，女，9歲，因血尿伴蛋白尿50天就診于我院兒科。常規(guī)檢查示：尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)859.3/μL↑、尿蛋白定量3.34 g/24h↑。聽(tīng)力及眼底檢查未發(fā)現(xiàn)異常。腎穿刺活檢術(shù)光鏡下15個(gè)腎小球中2個(gè)節(jié)段硬化，余腎小球偶見(jiàn)系膜區(qū)輕度增寬，囊壁節(jié)段增厚。腎小管間質(zhì)輕度慢性病變，多灶性萎縮、基膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)顆粒變性，間質(zhì)纖維化伴少量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞多灶性分布。電鏡下顯示腎小球系膜區(qū)偶見(jiàn)增寬，基膜偏?。?0%～70%）。厚度 130～250 nm，較厚處250～460 nm，基膜致密層未見(jiàn)撕裂分層。腎小球足細(xì)胞足突廣泛融合（50%～60%）。免疫熒光檢查見(jiàn)腎小球IgM+彌漫分布，呈顆粒狀沉積于系膜區(qū)。腎組織冰凍切片Ⅳ型膠原檢查：α3、α5鏈均節(jié)段缺失。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)及病理檢查結(jié)果，該患兒高度疑診為Alport綜合征。臨床建議行基因檢測(cè)明確診斷。

1.2 家系調(diào)查和樣本收集對(duì)患兒3代以?xún)?nèi)的親屬進(jìn)行家系調(diào)查，包括年齡、性別、患病情況等，繪制家系圖。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2015NZKY-007-004），獲得患兒及家屬知情同意后采集家系內(nèi)共8人外周靜脈血。

1.3 高通量測(cè)序及家系驗(yàn)證按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取患兒及家屬全基因組DNA。本實(shí)驗(yàn)前期設(shè)計(jì)并制定了包含78個(gè)常見(jiàn)遺傳性腎病相關(guān)致病基因的液相探針捕獲芯片，包括COL4A3、COL4A4、COL4A5基因在內(nèi)［11］。應(yīng)用此目標(biāo)序列捕獲芯片聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)78個(gè)相關(guān)基因外顯子是否存在可疑致病突變，檢出的可突變與千人數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP外顯子數(shù)據(jù)庫(kù)及華大本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用PolyPhen-2、SIFT和MutationTaster軟件進(jìn)行突變功能預(yù)測(cè)。Phylop軟件用于SNPs保守性預(yù)測(cè)。對(duì)8位家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序。針對(duì)檢測(cè)出的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI3730xl DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙端測(cè)序，并比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

1.4 剪接突變預(yù)測(cè)采用在線(xiàn)分析軟件Human Splicing Finder3.0、MutPredSplice預(yù)測(cè)突變對(duì)剪接過(guò)程的影響。

1.5 Minigene技術(shù)

1.5.1 質(zhì)粒構(gòu)建以患者或正常家系成員的基因組DNA為模板，根據(jù)基因變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)COL4A5基因外顯子32、33，內(nèi)含子32及上下游側(cè)翼序列（1408bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見(jiàn)表1。在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR產(chǎn)物純度檢測(cè)，并切膠純化得到目的片段。將PCAS2質(zhì)粒（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所張學(xué)教授贈(zèng)予）通過(guò)BamH1酶（酶切位點(diǎn)位于外顯子A、B之間）酶切后進(jìn)行膠回收純化。然后將目的片段和酶切質(zhì)粒用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基增殖12 h后，挑選單克隆菌落并進(jìn)行質(zhì)粒提取。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，分別得到野生型質(zhì)粒PCAS2-WT和突變型質(zhì)粒PCAS2-MT。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將293T細(xì)胞在90%DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞在六孔板上培養(yǎng)至60%～85%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照J(rèn)et Primer試劑說(shuō)明書(shū)，分別將PCAS2-WT、PCAS2-MT轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primer sequences of PCR amplification

1.5.3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析將轉(zhuǎn)染24 h后的293T細(xì)胞用TRIZOL提取RNA，置于-80℃保存。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄引物，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察PCAS2-WT、PCAS2-MT片段長(zhǎng)度變化；并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 家系調(diào)查該家系3代共10名成員，其中Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2均發(fā)現(xiàn)血尿，同時(shí)Ⅰ-2、Ⅲ-1合并有蛋白尿，家系成員血壓及腎功能均正常。家系內(nèi)否認(rèn)近親結(jié)婚史。家系圖見(jiàn)圖1。

圖1 一個(gè)中國(guó)Alport綜合征家系系譜圖Figure 1 Pedigree diagram of the Chinese family with Alport syndrome

2.2 基因分析先證者（Ⅲ-1）檢測(cè)出一COL4A5基因雜合變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。Sanger測(cè)序顯示此家系中所有患者（Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2）均攜帶c.2767G＞T雜合變異，而其他成員未檢出此變異，呈現(xiàn)家系共分離現(xiàn)象。生物信息學(xué)分析表明，COL4A5 c.2767G＞T為錯(cuò)義突變，造成Ⅳ型膠原α5鏈第923位甘氨酸置換為半胱氨酸，該變異在千人數(shù)據(jù)庫(kù)，dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)，ESP6500數(shù)據(jù)庫(kù)及華大基因本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中均未檢出，SIFT、PolyPhen-2、Mutation-Taster預(yù)測(cè)均為有害變異，Phylop軟件預(yù)測(cè)此突變位點(diǎn)在靈長(zhǎng)類(lèi)、脊椎動(dòng)物及哺乳動(dòng)物分值分別為0.594、5.903、2.466，均為保守序列。根據(jù)ACMG標(biāo)準(zhǔn)，此變異屬于可能致病性變異［12］。經(jīng)檢索人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)，此基因變異未見(jiàn)報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的基因變異。

HSF3.0預(yù)測(cè)此突變可能通過(guò)破壞野生型供體剪接位點(diǎn)、外顯子剪接增強(qiáng)子或產(chǎn)生新的外顯子剪接沉默子等途徑影響剪接過(guò)程；MutPredSplice預(yù)測(cè)該錯(cuò)義變異影響剪接分值為0.9分，可能為剪接變異。

2.3 Minigene實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳得到兩條不同長(zhǎng)度的條帶，見(jiàn)圖2。PCAS2-WT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與預(yù)期的長(zhǎng)度450bp一致；而PCAS2-MT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶低于450bp，說(shuō)明突變型質(zhì)粒發(fā)生了剪接變化，得到了不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

圖2 Minigene實(shí)驗(yàn)RT-PCR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析Figure 2 RT-PCR transcription products of minigene assay

測(cè)序結(jié)果與參考序列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)PCAS2-WT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列為外顯子A、外顯子32、33和外顯子B，而PCAS2-MT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列為外顯子A、外顯子33和外顯子B，見(jiàn)圖3。因此，COL4A5基因上c.2767G＞T變異在293T細(xì)胞上造成32號(hào)外顯子缺失。

圖3 Minigene實(shí)驗(yàn)RT-PCR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分析Figure 3 RT-PCR transcription products of minigene assay

3 討 論

19 世紀(jì)，F(xiàn)liter［1］和 Gregory等［13］分別提出了 AS的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)臨床表現(xiàn)、家族史，結(jié)合腎組織病理檢查和Ⅳ型膠原α鏈染色，大多數(shù)病例可明確診斷。然而在實(shí)際的臨床工作中，幼年及女性AS患者常呈現(xiàn)不典型的腎組織病理改變，且部分患者缺乏腎外表現(xiàn)，故基因診斷是確診Alport綜合征的有效手段［14-15］。

AS是由于編碼Ⅳ型膠原α鏈的基因COL4An基因發(fā)生突變導(dǎo)致，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因分別含有52、48、51個(gè)外顯子，基因龐大且無(wú)熱點(diǎn)突變，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序耗費(fèi)人力、物力，因此目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，成為一種高效、低成本的基因診斷方法。此前，本課題組設(shè)計(jì)了包含78個(gè)遺傳性腎病相關(guān)基因的捕獲芯片，聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)遺傳性腎病患者進(jìn)行檢測(cè)，能在較短的周期內(nèi)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的基因突變［11，16］。本研究納入一個(gè)臨床疑似AS家系，先證者腎活檢電鏡缺乏典型表現(xiàn)，但腎組織膠原染色異常。為進(jìn)一步確診，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)雜合COL4A5基因變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys）。

本研究中發(fā)現(xiàn)的COL4A5基因變異c.2767G＞T（p.Gly923Cys），通常認(rèn)為此類(lèi)變異是造成單個(gè)氨基酸替換的錯(cuò)義突變。但考慮到該突變位于32號(hào)外顯子最后1位堿基，有可能影響RNA剪接過(guò)程。有文獻(xiàn)報(bào)道，外顯子上的錯(cuò)義突變經(jīng)檢測(cè)mRNA后證實(shí)為剪接突變［17-19］。因此，本研究首先利用軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該變異可能影響pre-mRNA剪接。為進(jìn)一步驗(yàn)證其致病性，進(jìn)行了體外Minigene實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，此突變導(dǎo)致COL4A5基因32號(hào)外顯子90個(gè)堿基完全缺失。COL4A5基因編碼產(chǎn)物為Ⅳ型膠原α5鏈，共有1685個(gè)氨基酸，其中富含甘氨酸三聯(lián)結(jié)構(gòu)（Gly-X-Y）的中間膠原區(qū)對(duì)維持Ⅳ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用。c.2767G＞T突變位于膠原編碼區(qū)，造成了10個(gè)Gly-X-Y序列的缺失，可能產(chǎn)生不穩(wěn)定的Ⅳ型膠原并影響其正常功能。大多數(shù)遺傳性疾病的突變分析只在基因組DNA水平進(jìn)行，少有突變通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)mRNA表達(dá)及剪接過(guò)程的影響。在已經(jīng)DNA和RNA水平驗(yàn)證的錯(cuò)義突變中，約50%的突變被證實(shí)產(chǎn)生了異常剪接［20］。除經(jīng)典剪接位點(diǎn)外，內(nèi)含子上的分支位點(diǎn)、多聚嘧啶序列，以及外顯子和內(nèi)含子上的剪接增強(qiáng)子（ESE/ISE）和沉默子（ESS/ISS）發(fā)生突變均可能影響pre-mRNA剪接［21］。外顯子最后1位堿基發(fā)生突變可能通過(guò)影響臨近內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)，使得剪接體錯(cuò)誤識(shí)別，進(jìn)而產(chǎn)生異常的剪接產(chǎn)物［22］。因此，對(duì)外顯子及深度內(nèi)含子上的可疑突變應(yīng)同時(shí)進(jìn)行DNA和RNA水平的分析，有助于理解疾病的分子發(fā)病機(jī)制。

確定一個(gè)特定的突變是否影響剪接，最直接有效的方法就是提取患者腎或者皮膚組織中的RNA進(jìn)行分析，而組織提取為侵入性實(shí)驗(yàn)。有研究者成功從AS患者的30根發(fā)根中提取出RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析［17，23］。遺憾的是，本例患者拒絕提供發(fā)根，而外周血中的RNA表達(dá)量極低，導(dǎo)致我們無(wú)法進(jìn)行體內(nèi)RNA水平的分析。因此，本研究?jī)H采用體外Minigene技術(shù)分析潛在的剪接突變［24-25］。此前，研究者對(duì)其他遺傳性腎病基因突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Minigene實(shí)驗(yàn)結(jié)果與患者體內(nèi)RNA表達(dá)基本一致，證實(shí)Minigene技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的剪接突變分析方法［26-27］。

總之，本研究通過(guò)目標(biāo)序列捕獲芯片聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)在一中國(guó)XLAS家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的COL4A5基因c.2767G＞T外顯子雜合突變；并通過(guò)體外Minigene實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此突變影響mRNA剪接過(guò)程，導(dǎo)致COL4A5基因32外顯子缺失。