盧曉倩，陳先俠，王海霞，蘇雙艷，陳曉宇

0 引 言

兇險(xiǎn)性前置胎盤(pán)（pernicious placenta previa，PPP）指既往有剖宮產(chǎn)史或子宮肌瘤剔除術(shù)史，此次妊娠為前置胎盤(pán)，胎盤(pán)附著于原手術(shù)瘢痕部位者，發(fā)生胎盤(pán)粘連、植入和致命性大出血的風(fēng)險(xiǎn)高［1-2］。PPP常導(dǎo)致致命性的產(chǎn)后大出血、器官丟失率增加，嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦的生命安全。研究表明，PPP患者機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，真核生物細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和去乙?；福╯irtuins，SIRTs）家族中的去乙?；窼IRT3可使MnSOD脫乙?；M(jìn)而活化MnSOD，從而使得超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，降低線(xiàn)粒體氧自由基（ROS）生成，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的能量代謝和抗氧化損傷［3］。本研究通過(guò)檢測(cè)MnSOD與SIRT3在PPP伴胎盤(pán)植入患者中的表達(dá)，以期為探討胎盤(pán)植入發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2014年1月至2018年6月我院住院分娩的PPP合并胎盤(pán)植入患者90例，患者均具有前次剖宮產(chǎn)手術(shù)史，并根據(jù)第9版教科書(shū)按照胎盤(pán)絨毛侵入子宮肌層深度分為30例胎盤(pán)粘連患者（粘連組）、30例胎盤(pán)植入患者（植入組）及30例穿透性胎盤(pán)植入患者（穿透組）。選取同時(shí)期正常分娩的孕產(chǎn)婦胎盤(pán)組織30例（對(duì)照組）。本次研究通過(guò)安徽省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意［批準(zhǔn)文號(hào)：2013（10）］，研究組和對(duì)照組孕產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年歐洲異常侵入性胎盤(pán)工作組關(guān)于《異常侵襲性胎盤(pán)超聲描述標(biāo)準(zhǔn)化建議》對(duì)PPP進(jìn)行診斷：①子宮漿膜與膀胱后壁交界面豐富血流信號(hào)；②胎盤(pán)下（胎盤(pán)床）的豐富血流信號(hào)；③胎盤(pán)內(nèi)的穿支（腔隙）血流，連接子宮肌層甚至膀胱；④湍流的血流信號(hào)流入胎盤(pán)漩渦，伴有高速血流頻譜；⑤胎盤(pán)與子宮壁間存在垂直穿梭的吻合支（診斷結(jié)果由產(chǎn)科醫(yī)師和超聲醫(yī)師共同評(píng)估而得出）［4］。胎盤(pán)植入診斷標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤(pán)主體附著部位于子宮下段處，胎兒娩出后胎盤(pán)不能自行剝離或人工剝離不能完全剝離者。術(shù)后病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為子宮平滑肌肌層內(nèi)存在絨毛組織。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本與試劑胎盤(pán)娩出后，迅速取胎盤(pán)母體面的胎盤(pán)組織2塊（大小約為1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm）。取材時(shí)，對(duì)照組選取母體面胎盤(pán)中間帶部位，植入組選取胎盤(pán)粘連、植入部位，同時(shí)注意避開(kāi)出血、壞死、鈣化處。使用Western blot檢測(cè)組織迅速置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?；另一塊標(biāo)本常規(guī)處理，制備石蠟切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，標(biāo)本固定于4%甲醛溶液。主要相關(guān)的試劑包括兔抗人MnSOD、SIRT3多克隆抗體（購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司），即用型SP免疫組化和二氨基聯(lián)苯（DAB）顯色試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)MnSOD、SIRT3表達(dá)及判定采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)蛋白表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。胎盤(pán)組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，厚4 μm連續(xù)切片，烤片、脫蠟、微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗（1∶100稀釋?zhuān)?0 μL，4℃孵育過(guò)夜，沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗（1∶200稀釋?zhuān)?0 μL，滴加DAB工作液顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。利用Nikon 4500顯微鏡攝片，MnSOD、SIRT3表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)或胞核染色成棕黃色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 Western blot分析 MnSOD、SIRT3表達(dá)取出低溫保存的胎盤(pán)組織，在玻璃勻漿器中，加入1%體積分?jǐn)?shù)的RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，冰水中超聲破裂，4℃、以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，離心半徑10 cm。取上清液提取蛋白，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，蛋白樣品煮沸變性，SDS-PAGE電泳，分別加入兔抗人MnSOD、SIRT3和β-actin多克隆抗體（均為1∶1500稀釋?zhuān)?，蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，生物素化羊抗兔二抗（1∶2000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像，測(cè)定目標(biāo)條帶的光密度值，以β-actin為內(nèi)參，比較同一胎盤(pán)組織條帶與β-actin的光密度值，進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況比較本組PPP合并胎盤(pán)植入患者年齡26～44歲，分娩孕周30+3～39+4周；對(duì)照組患者年齡21～31 歲，孕周 34+6～41+2周。穿透組患者年齡、孕次及人流次數(shù)均顯著高于粘連組和植入組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組分娩的兇險(xiǎn)性前置胎盤(pán)合并胎盤(pán)植入患者一般資料比較(xˉ±s)Table 1 Comparison of baseline characteristics in three groups(xˉ±s)

2.2 胎盤(pán)組織中MnSOD、SIRT3的免疫組化表達(dá)情況免疫組織化學(xué)SP染色結(jié)果顯示，MnSOD、SIRT3陽(yáng)性染色結(jié)果在對(duì)照組表達(dá)較高，主要位于胎盤(pán)平滑肌細(xì)胞和絨毛細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核；而PPP合并胎盤(pán)植入患者表達(dá)明顯降低，且MnSOD、SIRT3陽(yáng)性染色表達(dá)與胎盤(pán)植入程度之間存在一定關(guān)聯(lián)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 胎盤(pán)組織MnSOD蛋白表達(dá)（SP×200）Figure1 ExpressionofMnSODproteininplacenta（SP ×200）

圖2 胎盤(pán)組織中SIRT3蛋白表達(dá)（SP×200）Figure 2 ExpressionofSIRT3proteininplacenta（SP×200）

2.3 Western blot檢測(cè)胎盤(pán)組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組MnSOD與SIRT3蛋白表達(dá)灰度值較高，而粘連組、植入組、穿透組表達(dá)較低，見(jiàn)圖3。Image J凝膠成像分析軟件分析表明，對(duì)照組MnSOD/β-actin、SIRT3/β-actin均顯著高于粘連組、植入組和穿透組胎盤(pán)組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖3 不同組胎盤(pán)組織蛋白表達(dá)Western blot圖Figure 3 Western blot of different proteins in placenta

表2 胎盤(pán)組織中MnSOD/β-actin與SIRT3/β-actin相對(duì)蛋白表達(dá)比較(xˉ±s)Table 2 Expression of relative proteins of MnSOD and SIRT3 in placenta(xˉ±s)

3 討 論

PPP發(fā)生率不斷上升，其中既往僅有1次剖宮產(chǎn)術(shù)史者的胎盤(pán)植入發(fā)生率為11%～27%，剖宮產(chǎn)史≥4次者發(fā)生胎盤(pán)植入的風(fēng)險(xiǎn)則上升至約67%［5-7］。本研究資料中也證實(shí)，剖宮產(chǎn)次數(shù)與胎盤(pán)植入發(fā)生率密切相關(guān)。PPP伴胎盤(pán)植入因治療不當(dāng)會(huì)引起嚴(yán)重產(chǎn)后出血，甚至引發(fā)母胎死亡等嚴(yán)重不良妊娠結(jié)局［8］。為顯著改善PPP患者預(yù)后，專(zhuān)家建議建立全面處理胎盤(pán)植入的多學(xué)科團(tuán)隊(duì)對(duì)孕產(chǎn)婦病情進(jìn)行全面的評(píng)估以制定充分的個(gè)性化治療方案，進(jìn)而為母胎安全保駕護(hù)航［9-10］。

由于前次剖宮產(chǎn)史或子宮肌瘤剔除史導(dǎo)致子宮內(nèi)膜原有生理結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而影響底蛻膜正常發(fā)育，使得絨毛易侵襲子宮肌層或漿膜層而形成胎盤(pán)植入。因此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者著重于對(duì)胎盤(pán)植入發(fā)病機(jī)制的深入研究［10］。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)能量和自由基產(chǎn)生場(chǎng)所，氧自由基清除劑MnSOD可催化超氧陰離子進(jìn)行歧化反應(yīng)的作用，而線(xiàn)粒體MnSOD與病理妊娠密切相關(guān)［11］。正常妊娠時(shí)，MnSOD水平在孕期高于非孕期。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)ROS生成與抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為ROS自由基生成超過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)，或抗氧化劑活性降低［12］。然而正常妊娠伴隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生，機(jī)體抗氧化酶活性水平呈代償性升高，使得體內(nèi)氧化與抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，因而對(duì)孕婦本身并無(wú)不良影響［12］。SOD對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡中起著至關(guān)重要的作用，主要是通過(guò)催化歧化反應(yīng)清除體內(nèi)自由基，是人體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)［13］。當(dāng)孕婦處于PPP時(shí)，胎盤(pán)氧化應(yīng)激損傷加重，此種病理妊娠狀態(tài)下產(chǎn)生的ROS超出機(jī)體的清除能力，進(jìn)而出現(xiàn)所謂“氧化應(yīng)激狀態(tài)”，且ROS生成可以直接損傷抗氧化酶，兩者均導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)，損傷產(chǎn)物增加。本研究通過(guò)免疫組化SP法和Western blot實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，與對(duì)照組相比較，研究組中MnSOD表達(dá)逐漸降低，提示胎盤(pán)植入患者體內(nèi)抗氧化能力減弱，間接證明了胎盤(pán)植入病理生理發(fā)展機(jī)制中過(guò)氧化反應(yīng)起著重要作用。由此可認(rèn)為胎盤(pán)組織中抗氧化酶活性水平下降可能是胎盤(pán)氧化應(yīng)激損傷水平升高的原因。

人類(lèi) SIRTs家族有 7種亞型（SIRT1-7），其中SIRT3主要位于線(xiàn)粒體，且是唯一具有去乙酰化酶活性的SIRTs，去乙?；窼IRT3可以使得線(xiàn)粒體的組蛋白/非組蛋白的乙?；鞍兹ヒ阴；?，從而增加線(xiàn)粒體氧自由基清除能力，抑制ROS的過(guò)多產(chǎn)生和蓄積，使線(xiàn)粒體功能處于穩(wěn)定狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［14］。SIRT3可以引起MnSOD-122位賴(lài)氨酸殘基去乙?；?，導(dǎo)致MnSOD活化，降低線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生，從而參與抗氧化應(yīng)激損傷作用［15］。本實(shí)驗(yàn)胎盤(pán)組織的免疫組化結(jié)果證實(shí)，對(duì)照組胎盤(pán)組織中SIRT3蛋白表達(dá)明顯升高，說(shuō)明正常孕婦機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；而PPP研究組胎盤(pán)組織中SIRT3蛋白表達(dá)明顯降低，且隨著絨毛膜植入程度的增加，SIRT3蛋白與MnSOD蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)相似的降低趨勢(shì)。進(jìn)一步經(jīng)Western blot方法檢測(cè)胎盤(pán)組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達(dá)情況，與免疫組化的表達(dá)情況類(lèi)似，說(shuō)明在胎盤(pán)植入患者機(jī)體清除自由基、維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的能力下降。

綜上，本研究結(jié)果顯示PPP伴胎盤(pán)植入孕產(chǎn)婦胎盤(pán)組織中MnSOD、SIRT3表達(dá)降低，且與病變程度具有一定程度的相關(guān)性，結(jié)果表明MnSOD、SIRT3兩者均參與了胎盤(pán)植入的發(fā)病過(guò)程，有助于對(duì)胎盤(pán)植入的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期改善母嬰結(jié)局。