王茂偉,周利,*,高靜思,朱佳

1.青島理工大學環(huán)境與市政工程學院,青島 266033

2.哈爾濱工業(yè)大學深圳研究生院,深圳 518055

3.深圳職業(yè)技術學院建筑與環(huán)境工程學院,深圳 518055

0 前言

隨著人類生產(chǎn)、生活等活動的進行,水體富營養(yǎng)化問題越來越嚴重,國內(nèi)太湖、滇池和巢湖等湖泊的水體富營養(yǎng)化問題已經(jīng)對人們的生存環(huán)境質(zhì)量構成了潛在的威脅[1-3]。南方某市某梯級水庫群發(fā)生藍藻水華時的優(yōu)勢種群為偽魚腥藻[4],偽魚腥藻也是富營養(yǎng)化水體中常見的有毒水華藻種[5-6],常作為微囊藻的伴生種被微囊藻的膠鞘多糖包被而一起在富營養(yǎng)化水體中形成水華。同時,該藻能夠產(chǎn)生典型嗅味物質(zhì)2-甲基異莰醇(2-MIB)[7-8],嚴重影響水質(zhì)安全。但目前國內(nèi)外對該課題的研究較少,關于pH 對偽魚腥藻的生長特性和光合生理方面的研究更是鮮有報道。

有學者認為水體pH 是變化的,不能作為預測藻類生長量的指標[9],但是鑒于水華的發(fā)展和形成是各種因素影響下的綜合結果,研究者們開展了很多關于pH 對微藻影響的研究。有大量研究表明,不僅pH 會影響藻類生長,藻類的生長也會影響水體pH,改變后的pH 也是大多數(shù)藻類能夠適應的pH 環(huán)境[10-12]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)藍藻偏好較高pH,但也有研究表明,在酸性條件下,也會發(fā)生藍藻水華[13]。本試驗以偽魚腥藻為研究對象,研究不同pH 對其生長及葉綠素熒光參數(shù)的影響,為偽魚腥藻增殖和水華暴發(fā)機理的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需偽魚腥藻(FACHB-1277)購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫,用BG 11 培養(yǎng)基培養(yǎng),經(jīng)實驗室擴大培養(yǎng)后用于試驗。試驗在光照培養(yǎng)箱中進行,光照強度2000 lx,光暗比12 h:12 h,溫度25 ,℃ 為保證光照均勻,每天定時手動搖瓶3 次,并任意交換錐形瓶位置。實驗所用所有玻璃器皿均經(jīng)121 ,30℃ min 高溫滅菌后使用。

1.2 接種

取適量的藻液以5000 r·min-1的速度離心10 min,棄掉上清液,用15 mg·L-1的碳酸氫鈉溶液洗滌后離心,重復3 次,用無菌水稀釋后分別接種于試驗所用BG 11 培養(yǎng)基內(nèi)。以BG 11 培養(yǎng)基為參比,接種密度為OD665≈ 0.02[14]。

1.3 試驗設置

試驗一共分為2 個試驗組,a 組自試驗開始時調(diào)整pH 至設定值不再人為調(diào)節(jié)并每天測定一次pH,b組每天測定pH 后用0.1 mol·L-1HCl 或者NaOH 調(diào)節(jié)pH 至初始設定值。2 組試驗設置的pH 梯度均為3、5、7、8、9、11、13。每個處理組設置三個平行樣。

1.4 葉綠素a(Chla)及葉綠素熒光參數(shù)的測定

利用浮游植物分類熒光儀(PHYTO-PAM WALZ)對葉綠素熒光各個參數(shù)進行測定。測定葉綠素熒光參數(shù)前將樣品暗適應5 min,各參數(shù)可在儀器上直接讀出。Fv/Fm為最大光系統(tǒng) Ⅱ( PSⅡ )的光能轉換效率,可看作潛在最大的光合效率;ETR 為光抑制時的最大潛在相對電子傳遞速率,可作為一定光強下單位生物量內(nèi)光合作用速率的探針;Ik為半飽和光強,反映了浮游植物光適應能力。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 進行單因素方差分析,利用Origin 8.0 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 pH 對偽魚腥藻葉綠素a 含量的影響

不同pH 條件下2 組試驗的葉綠素a 濃度變化情況如圖1所示(a 代表未調(diào)控pH 試驗組,b 代表調(diào)控pH 試驗組,下同)。單因子方差分析表明,在整個培養(yǎng)周期中,2 組試驗中pH 對偽魚腥藻葉綠素a 濃度影響均極顯著(P＜0.01)。pH 為3、13 試驗組的偽魚腥藻接種后便死亡。不調(diào)控pH 試驗組中,在pH為5—11 范圍內(nèi)偽魚腥藻均能正常生長,但pH 5 試驗組葉綠素a 濃度顯著(P＜0.05)低于7—11 試驗組,pH 為7—11 試驗組葉綠素a 濃度差異不顯著(P＞ 0.05)。

調(diào)控pH 試驗中,pH 5 試驗組在試驗前7 d 葉綠素a 含量略微增長,從第8 d 開始葉綠素a 濃度接近0 μg·L-1。在pH 為7—11 范圍內(nèi),偽魚腥藻葉綠素a含量與pH 顯著正相關(P＜0.05),而且pH 為9 和11試驗組的葉綠素a 含量高于未調(diào)控試驗組中相應pH下葉綠素a 含量。

2.2 試驗期間pH 動態(tài)變化情況

圖1 試驗期間偽魚腥藻葉綠素a 含量變化曲線 Figure1 Curve of Chlorophyll a content of Pseudanabaena sp.in the experiment

圖2 試驗期間pH 變化情況 Figure2 Change of pH in the experiment

試驗期間各試驗組實際pH 變化情況如圖2所示。未人為調(diào)控pH 試驗中,在試驗開始前4 d,初 始pH 為5—9 的試驗組pH 均迅速上升,pH 為11 的試驗組pH 在試驗前3 d 下降后也迅速上升,初始pH為5—11 試驗組pH 最終調(diào)節(jié)到約10.9—11.5 范圍內(nèi)。人為調(diào)控pH 試驗組的pH 變化趨勢未調(diào)控pH組類似,不同的是pH 為5 的試驗組在試驗第2 d pH上升后,從第3 d 開始,隨著藻細胞的死亡,pH 迅速下降,而且調(diào)控pH 試驗中各組之間pH 差異較大,初始pH 為7—11 試驗組pH 最終調(diào)節(jié)到約9.5—11.3。2 組試驗中,pH 為3 和11 的試驗組pH 基本保持不變。通過以上分析說明偽魚腥藻偏好堿性環(huán)境,而且對水體的適應能力及調(diào)節(jié)能力較強,對pH 為5—11 水體能迅速作出反應,調(diào)節(jié)pH 至適宜生長的范圍。

2.3 pH 對偽魚腥藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.3.1 pH 對偽魚腥藻最大光能轉化效率(Fv/Fm)的影響

pH 對偽魚腥藻最大光能轉化效率(Fv/Fm)的影響如圖3所示。從圖中可以看出,未調(diào)控pH 試驗中,Fv/Fm總體趨勢為先增大后減小,pH 為11 試驗組的Fv/Fm最大,在整個試驗周期中維持在0.28以上,pH 為5 試驗組Fv/Fm低于其它實驗組。調(diào)控pH 試驗中,pH 為11 試驗組Fv/Fm顯著大于其它試驗組,pH 為7—9 試驗組差異不大,pH 為5 試驗組Fv/Fm顯著低于其它試驗組,從實驗第5 d 開始便趨于0。

2.3.2 pH 對偽魚腥藻最大相對電子傳遞速率(ETR)的影響

pH 對偽魚腥藻最大相對電子傳遞速率的影響如圖4所示。從圖中可以看出,在整個試驗周期內(nèi),2 組試驗ETR 均先增大后減小,pH 為5 的試驗組ETR均顯著低于其它試驗組,其中人為調(diào)控pH 試驗組的ETR 從第5 d 開始趨于0,而且該組試驗中,ETR隨著pH 增大而增大。

2.3.3 pH 對偽魚腥藻半飽和光強(Ik)的影響

pH 對偽魚腥藻半飽和光強的影響如圖5所示。從圖中可以看出,2 組試驗中除pH 為5 試驗組外,其它pH 下的Ik差異不大,而且在培養(yǎng)期內(nèi)的變化趨勢基本一致。未人為調(diào)控pH 試驗中pH為5 試驗組的Ik值在實驗后期pH 上升,而調(diào)控pH試驗中pH 為5 試驗組的Ik值從第5 d 開始迅速下降,趨向于0。

圖3 pH 對偽魚腥藻最大光能轉化效率的影響 Figure3 Effect of pH on Fv/Fm of Pseudanabaena sp.

圖4 pH 對偽魚腥藻最大相對電子傳遞速率的影響 Figure4 Effect of pH on ETR of Pseudanabaena sp.

圖5 pH 對偽魚腥藻半飽和光強的影響 Figure5 Effect of pH on Ik of Pseudanabaena sp.

3 討論

水體pH 主要從兩方面對微藻產(chǎn)生影響,一方面通過改變環(huán)境酸堿度,酸性或堿性太強均會影響細胞膜的滲透性及酶的活性等,從而對藻細胞產(chǎn)生傷害;另一方面通過影響碳酸鹽平衡系統(tǒng)及不同形態(tài)無機碳(等)分配關系而影響藻類的生長。其中自由CO2是藻類光合作用易于吸收的形態(tài),當pH 達到9.0 時,水體中的CO2濃度很低[15-16]。此時,水體中的碳酸氫鹽為主要碳源,支彥麗[17]利用pH 漂移技術,從碳酸氫鹽的利用角度,將藻類分為三類,第一類是不能利用HCO3-,漂移試驗中pH 終值一般很少超過9;第二類是具有利用HCO3-能力的,其pH 可漂移至9;第三類是強HCO3-利用者,本試驗中偽魚腥藻最適初始pH 為11,顯然為第三類。藻類利用碳酸氫鹽的機理為:藻類能夠借助細胞表面的碳酸酐酶(CA)將水環(huán)境中的HCO3-轉化為可以被吸收和固定的CO2[18-19],或者通過陰離子交換機制使HCO-3直接進入胞內(nèi),交換出OH-[20-21],完成碳酸氫鹽的利用,其中前者叫做無機碳濃縮機制(CCM),CA 在此過程中起關鍵作用。

2 組試驗中,偽魚腥藻在pH 為3 和13 條件下均不能生長,但在初始pH 為堿性的條件下的生長情況明顯好于酸性條件下,這與大多數(shù)藍藻偏好堿性條件相似。而且偽魚腥藻對環(huán)境有很強的適應與調(diào)節(jié)能力,未人為調(diào)控試驗組中,對pH 5—11 的環(huán)境調(diào)節(jié)能力很強,使水體最終pH 趨向10.9—11.5,這也可以認為是偽魚腥藻的最適pH 范圍,其中初始pH 5 的試驗組pH 最高上升到11.2,上升了6.2個單位。調(diào)控pH 試驗中,雖然每天調(diào)控pH 至初始值降低了其自我調(diào)控能力,但偽魚腥藻均努力調(diào)節(jié)pH 至較適宜的生長范圍。藍藻大多偏好堿性環(huán)境,但最適pH達11.0左右的藻卻很少,銅綠微囊藻的最適pH 為9.5 左右[22-23],水華魚腥藻為8.0—9.0,浮游顫藻為7.0—8.0[16]。pH 影響藻類對營養(yǎng)鹽的吸收、細胞內(nèi)生化組分以及各種酶的活性,離子及酶在水體中的解離狀態(tài)和行為也受pH 影響,過高或者過低的pH 均會對以上的生理活動造成不利影響[24]。維持細胞內(nèi)外的離子平衡對藻類的生長也非常重要,水體中pH 的變化使得藻類需要消耗大量的能量來維持這個平衡[25],隨著培養(yǎng)周期的延長,藻液pH 總體升高,但是低pH 條件下,pH 的波動范圍更大,這也是本試驗中低pH 試驗條件下偽魚腥藻生長受到抑制的原因之一。藻類的光合作用、營養(yǎng)鹽吸收等生理活動均需要酶的參與,偽魚腥藻的最適pH 能達到11,可能是此pH 條件下,偽魚腥藻細胞用于營養(yǎng)鹽吸收、光合作用等酶的活性最高,在如此高的pH 條件下,偽魚腥藻的細胞也沒有受到破壞,說明其抗氧化系統(tǒng)[26]功能非常強大,能有效保護細胞膜的完整性。而且此pH 下,水體中幾乎不含CO2,偽魚腥藻需要啟動上述提及的無機碳濃縮機制(CCM)來提供足夠的碳源,可見偽魚腥藻的具有很高的CCM 功能。

當植物受到脅迫時,用于光化學反應的能量下降,而以熱能和熒光形式耗散的能量增加,因此葉綠素熒光參數(shù)的變化可以反應出植物受脅迫的程度,是光合作用良好的探針[27]。本試驗調(diào)控pH 試驗中pH 5 試驗組的各熒光參數(shù)均顯著低于其它組,并且隨著培養(yǎng)時間的增加,各熒光參數(shù)趨于0,說明此條件下的偽魚腥藻光合系統(tǒng)受到破壞。而不人為調(diào)控試驗中pH 5 試驗組的各熒光參數(shù)雖然低于其它組,但是各參數(shù)均處于正常范圍內(nèi),光合系統(tǒng)并未被破壞。在pH 7—11 范圍內(nèi),Fv/Fm、ETR 總體上隨pH增大而增大,各試驗組的Ik值差異不大。但是試驗后期,未調(diào)控試驗中,pH 5 試驗組的Ik值上升,處于較大值,筆者認為原因是偽魚腥藻在經(jīng)歷短期的逆境(低pH)馴化后,隨著pH 恢復正常,使其具有了更強的耐受飽和光強的能力,郭連旺[28-29]等也指出,適當?shù)哪婢冲憻?有利于提高植物的某些光合能力。而且生物中普遍存在補償與超補償效應,是生物體在遭受逆境脅迫后,其生長和生理機能受到制約,但當恢復到適宜的生長條件后,生長狀況和生理指標得到不同程度的恢復[30-31]。當pH 5 處理組pH 恢復正常后,葉綠素a 濃度雖然未超過其它試驗組,但其生長速度卻顯著加快,Ik值也增大,這應該是出現(xiàn)補償效應的結果。

偽魚腥藻對水體pH 的適應范圍大,調(diào)控能力強,水體pH 不適時仍有發(fā)生偽魚腥藻水華的可能,因此通過調(diào)控pH 來控制偽魚腥藻水華是有風險的,若要調(diào)節(jié)pH 來控制偽魚腥藻的生長,必須使pH 處于恒定狀態(tài)。本試驗由于條件所限,沒有從分子生物學方面探究偽魚腥藻對pH 的適應及調(diào)控能力,以后條件允許,應該加強此方面的研究。

4 結論

在不人為調(diào)節(jié)pH 條件下,偽魚腥藻在pH 5—11 范圍內(nèi)均能正常生長,在人為調(diào)節(jié)pH 條件下偽魚腥藻在pH 7—11 范圍內(nèi)均能正常生長,且pH 越大,生長情況越好。pH 為3 和13 條件下偽魚腥藻均不能生長。

偽魚腥藻對水體pH 的調(diào)節(jié)能力極強,在初始pH 5—11 范圍內(nèi),將pH 最終調(diào)至10.9—11.5,此pH范圍可以認為是偽魚腥藻最適pH 范圍。調(diào)控pH 試驗中,雖然每天調(diào)控pH 至初始值降低了其自我調(diào)控能力,但偽魚腥藻均努力調(diào)節(jié)pH 至較適宜的生長范圍。

水體pH 變化會影響偽魚腥藻的生長,偽魚腥藻的增殖也會影響水體pH,兩者交互作用,互為因果關系。

在pH 5—11 范圍內(nèi),Fv/Fm、ETR 總體上隨pH增大而增大,除pH 5 試驗組外各試驗組Ik值差異不明顯,不調(diào)控pH 試驗中,pH 5 試驗組后期Ik顯著增大,人為調(diào)控pH 試驗中pH 5 試驗組各熒光參數(shù)均顯著低于其他組。