劉飛飛 韓麗君 鮑光明 李 軍

急性顱腦損傷是神經(jīng)外科常見疾病之一。研究表明，急性顱腦損傷后的免疫炎性反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg 細(xì)胞失衡與自身免疫性疾病[2]、腦出血[3]、腦梗死[4]、腦動脈瘤[5]和帕金森病[6]等多種疾病關(guān)系密切，急性顱腦損傷可導(dǎo)致白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）等細(xì)胞因子的異常表達(dá)[7]。然而，目前關(guān)于Th17/Treg 細(xì)胞平衡與急性顱腦損傷程度關(guān)系的研究仍較少。因此，本研究通過觀察不同程度急性顱腦損傷患者及健康體檢者外周血Th17/Treg 細(xì)胞比例差異，并檢測血清相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23、TGFβ1 表達(dá)水平，探討Th17/Treg 細(xì)胞平衡與急性顱腦損傷的關(guān)系，為急性顱腦損傷的病情評估及預(yù)后判斷提供參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2015 年1 月—2016 年12 月在杭州市中醫(yī)院神經(jīng)外科住院治療的104 例急性顱腦損傷非手術(shù)患者作為研究對象。格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma scale，GCS）評分由兩位有經(jīng)驗(yàn)的神經(jīng)外科醫(yī)師判定，根據(jù)GCS 評分量表進(jìn)行分組[8]：GCS13～15 分為輕型顱腦損傷組34 例，GCS9～12 分為中型顱腦損傷組38 例，GCS3～8 分為重型顱腦損傷組32 例，另選取同期在杭州市中醫(yī)院體檢中心體檢的健康人30 名為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有參與者受試前均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 急性顱腦損傷診斷參照《臨床診療指南神經(jīng)外科學(xué)分冊》[9]及文獻(xiàn)[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者因外傷導(dǎo)致顱腦損傷；（2）入院時間不超過外傷發(fā)生后12h；（3）頭顱CT 和（或）核磁共振等影像學(xué)檢查提示點(diǎn)片狀高密度影，或者高、低密度影相兼。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～75歲；（2）所有患者均符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，且傷后6h 內(nèi)來院就診；（3）GCS 評分3～15 分。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）傷前明確有免疫疾病或嚴(yán)重感染者；（2）妊娠及哺乳期者；（3）近8 周內(nèi)服用過免疫抑制劑者；（4）合并其他臟器嚴(yán)重?fù)p傷，或合并有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病（如心、肺、肝、腎功能異常者）。

2 方 法

2.1 標(biāo)本采集 各組顱腦損傷患者入院后次日清晨抽取空腹靜脈血8mL 于肝素鈉抗凝管中，對照組血液標(biāo)本由我院體檢中心提供。其中3mL 靜脈血，3000r/min 離心10min，取上層血清置-80℃冰柜冷凍保存待用于EILSA 檢測。另5mL 靜脈血用Ficoll 密度梯度離心后分離外周單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用于 流 式 細(xì)胞 術(shù) 檢 測Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞。

2.2 外周血Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞檢測 流式細(xì)胞術(shù)的檢測參考文獻(xiàn)，使用Beckman coulter cell 多色流式細(xì)胞儀，以CD4+IL-17+代表Th17 細(xì)胞，以CD4+CD25+Foxp3+代表Treg 細(xì)胞，分析Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞的含量。流式分析相關(guān)抗體均購自美國BD 公司。

2.3 血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達(dá)水平測定 按人IL-17、IL-23、TGF-β1 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作（上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號20161010）。在450nm 處測定各標(biāo)本OD 值，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣品IL-17、IL-23、TGF-β1 表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，計量資料如符合正態(tài)分布多組間比較采用單因素方差分析，若差異有顯著性，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)，取雙側(cè)檢驗(yàn)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 四組一般資料比較 輕型顱腦損傷組34 例，男18 例，女16 例，年齡為26～74 歲，平均（48.06±13.08）歲；中型顱腦損傷組38 例，男20 例，女18 例，年齡29～73 歲，平均（49.81±14.48）歲；重型顱腦損傷組32 例，男17 例，女15 例，年齡25～75 歲，平均（47.34±12.99）歲；對照組30 名，男15 名，女15 名，年齡24～72 歲，平均（46.23±13.71）歲。四組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 各組外周血Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞百分率比較急性顱腦損傷患者外周血Th17 細(xì)胞百分率高于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組明顯高于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組明顯高于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）；中重型顱腦損傷患者外周血Treg 細(xì)胞百分率低于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組低于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組低于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）。與對照組比較，輕型顱腦損傷患者外周血Treg 細(xì)胞百分率降低不明顯（P＞0.05），見表1。

表1 健康對照者與急性顱腦損傷患者外周血Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞百分率比較（%，x±s）

3.3 各組血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達(dá)水平比較

急性顱腦損傷患者血清IL-17、IL-23 水平均高于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組高于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），輕型顱腦損傷組的IL-17、IL-23 水平最低；中重型顱腦損傷患者血清TGF-β1 水平低于對照組（P＜0.05），重型顱腦損傷組低于輕型和中型顱腦損傷組（P＜0.05），中型顱腦損傷組低于輕型顱腦損傷組（P＜0.05）。與對照組比較，輕型顱腦損傷患者血清TGF-β1 水平降低不明顯，見表2（P＞0.05）。

表2 健康對照者與急性顱腦損傷患者血清IL-17、IL-23、TGF-β1 表達(dá)水平比較（pg/mL，x±s）

4 討 論

研究證實(shí)，急性顱腦損傷后的血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、自由基損傷等可加重神經(jīng)功能受損，從而導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[12]。其中免疫炎性反應(yīng)在急性顱腦損傷中的作用尤為重要。Treg 細(xì)胞作為內(nèi)源性負(fù)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞可減輕腦缺血后再灌注損傷、抑制腦出血后免疫炎性反應(yīng)，對腦細(xì)胞起到保護(hù)作用[13-14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)動脈瘤破裂和腦疝均導(dǎo)致患者血清Treg 細(xì)胞含量降低[15]。Th17/Treg 細(xì)胞在人體中相對平衡，在維持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)腦梗死、帕金森或自身免疫疾病等情況時，Th17/Treg 細(xì)胞的平衡被打破，造成人體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)平衡被破壞，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。

本研究結(jié)果顯示，急性顱腦損傷患者外周血Th17 細(xì)胞水平明顯高于對照組，且腦損傷程度越重其升高越明顯；而急性顱腦損傷患者外周血中Treg細(xì)胞水平低于對照組，且重型顱腦損傷患者降低最明顯。該結(jié)果表明，Th17 過亢及Treg 不足可能與急性顱腦損傷后的腦損傷程度相關(guān)，Th17/Treg 細(xì)胞失衡參與急性顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的過程。

IL-17 是Th17 細(xì)胞介導(dǎo)炎性損傷的主要致炎因子，具有募集、動員與活化中性粒細(xì)胞的能力，可以促進(jìn)LI-6、IL-8 等細(xì)胞因子釋放，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫損傷[17]。IL-23 能夠增強(qiáng)Th17 細(xì)胞的增殖，維持Th17 細(xì)胞穩(wěn)定, 并刺激其相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IL-8 的分泌[18]。IL-23/IL-17 軸通過介導(dǎo)異常免疫炎性反應(yīng)，在急性腦出血[19]、腫瘤[20]、腦梗死[21]和自身免疫性疾病[22]等多種疾病中發(fā)揮作用。TGF-β1 屬于重要的抗炎因子，可促使Treg 細(xì)胞分化，在Treg 細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮作用。TGF-β1 能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和血管生成，具有腦保護(hù)的作用[23]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性顱腦損傷患者外周血IL-17、IL-23 水平較對照組明顯升高，且腦損傷程度越重其升高越明顯，表明IL-23/IL-17 軸參與急性顱腦損傷的發(fā)?。欢毙燥B腦損傷患者外周血TGF-β1水平較對照組降低，且重型顱腦損傷患者降低最明顯。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)促炎因子表達(dá)增多及抑炎因子表達(dá)不足可能與急性顱腦損傷后的腦損傷程度相關(guān)。

綜上所述，Th17/Treg 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子是免疫炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)因子，Th17/Treg 細(xì)胞失衡參與急性顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷過程。檢測Th17/Treg 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子水平有助于評估急性顱腦損傷患者病情。