姜麗麗，張中民，陳道玉，王 珍，薛宏宇，劉 勇*

（大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院，遼寧 盤錦 124221）

多酚類化合物是人類飲食中含量豐富的抗氧化劑，也是植物中常見的成分[1]。近年來，多種膳食多酚，如綠茶中的兒茶素沒食子酸[2]、西蘭花中的木犀草素、芹菜中的芹菜素[3-4]等被證明有抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性和緩解II型糖尿病的作用。白藜蘆醇是一種典型的酚類化合物，在葡萄、蘋果、李子和花生等多種植物中廣泛存在[5]。由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌等[6-7]多種生物活性被深度開發(fā)為膳食補(bǔ)充劑。

已有多項(xiàng)關(guān)于白藜蘆醇治療、改善II型糖尿病的臨床研究[8]。Liu Kai等[9]對11 項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)的薈萃分析表明，白藜蘆醇顯著改善了糖尿病患者的血糖調(diào)控能力和胰島素敏感性。在一項(xiàng)隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)中，對照組患者僅口服降糖藥（格列苯脲或者二甲雙胍），干預(yù)組患者每天口服250 mg白藜蘆醇和降糖藥。3 個月后，干預(yù)組患者的收縮壓、平均糖化血紅蛋白、總膽固醇含量等指標(biāo)得到了顯著改善，表明白藜蘆醇可有效改善血糖調(diào)控能力，可作為治療II型糖尿病的輔助藥物[10]。Rasouli等[11]通過分子對接和虛擬篩選的方法，推測咖啡酸、姜黃素和白藜蘆醇等多種酚類化合物可強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶的活性。在一些研究中，白藜蘆醇表現(xiàn)出了優(yōu)于阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用[12-13]。因此，白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)和抑制機(jī)制的研究具有一定意義。本研究通過酶動力學(xué)分析和計(jì)算模擬方法闡明白藜蘆醇結(jié)合α-葡萄糖苷酶的機(jī)制，以期討論其被開發(fā)為新型糖尿病藥物或作為膳食補(bǔ)充劑以降低血糖含量的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-葡萄糖苷酶（釀酒酵母）、白藜蘆醇、阿卡波糖、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 美國Sigma-Aldrich公司；對硝基苯酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1全波長多功能酶標(biāo)儀 德國Bio-Tek公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-葡萄糖苷酶活力的檢測

參照文獻(xiàn)[14-15]，釆用分光光度法測定α-葡萄糖苷酶活力。將α-葡萄糖苷酶溶解于0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，加入配制好的不同濃度的底物（pNPG溶液），與白藜蘆醇溶液混勻后置于全波長多功能酶標(biāo)儀中37 ℃下振蕩3 min，恒溫孵育15 min。反應(yīng)體系由pNPG、10 μL α-葡萄糖苷酶溶液、0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液和各濃度的白藜蘆醇組成，總體積為100 μL。α-葡萄糖苷酶活力表示為pNPG在37 ℃每分鐘由α-葡萄糖苷酶水解生成的對硝基苯酚在405 nm波長處的吸光度。

1.3.2 酶反應(yīng)動力學(xué)方程的建立

由于1.3.1節(jié)測得前15 min每分鐘生成對硝基苯酚的吸光度相同，即反應(yīng)速率相同，因此取15 min時(shí)生成對硝基苯酚的吸光度除以時(shí)間作為反應(yīng)初速度。按照1.3.1節(jié)方法分別測定底物濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 mmol/L時(shí)反應(yīng)的初速度，α-葡萄糖苷酶終濃度為0.4 U/mL，每個濃度做3 個平行，通過GraphPad軟件擬合酶反應(yīng)的動力學(xué)曲線，求出米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（vmax）。

1.3.3 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶IC50的測定

將不同濃度（終濃度0～160 μmol/L）的白藜蘆醇和不同濃度（0～62.5 mmol/L）的陽性對照阿卡波糖分別與終濃度0.6 mmol/L pNPG溶液混勻，加入10 μL 4 U/mL α-葡萄糖苷酶酶液，按1.3.1節(jié)方法測定α-葡萄糖苷酶活力。相對酶活力由實(shí)驗(yàn)組與空白組（不加抑制劑）反應(yīng)初速度的比值表示。繪制相對酶活力與白藜蘆醇濃度的關(guān)系圖，并求出相應(yīng)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 抑制動力學(xué)分析

將不同終濃度（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L）的白藜蘆醇與終濃度分別為0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mmol/L的底物溶液混勻，加入終濃度0.4 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，按1.3.1節(jié)方法測定α-葡萄糖苷酶活力。根據(jù)Lineweave-Burk方程，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)作圖，其中[S]是底物濃度，v是反應(yīng)速度，并繪制抑制作用動力學(xué)曲線以確定抑制類型。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶的同源建模

由于大多數(shù)α-葡萄糖苷酶抑制劑的生物測試采用釀酒酵母中α-葡萄糖苷酶[16-18]，因此選擇釀酒酵母α-葡萄糖苷酶進(jìn)行模擬對接。由于釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的三維晶體結(jié)構(gòu)尚未解析出來，本研究采用同源模建的方法[19]構(gòu)建α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)。首先，從美國國立生物技術(shù)信息中心蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）檢索獲得釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的序列信息（序列號：GAX66902.1）。將序列提交至SWISS-MODEL工作站[20]進(jìn)行序列比對，并根據(jù)序列一致性和模板蛋白解析度等參數(shù)手動選擇模板蛋白進(jìn)行模建。SWISS-MODEL服務(wù)器會基于OpenMM分子機(jī)制[21]對蛋白模型進(jìn)行能量最小化，保證蛋白模型的合理性。用SAVES網(wǎng)站（http：//services.mbi.ucla.edu/SAVES/）的PROCHECK[22]、ERRAT[23]等程序?qū)?gòu)建好的模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.6 分子對接模擬

本研究用BIOVIA Discovery Studio 2016程序中的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對接處理。有多項(xiàng)研究已經(jīng)探索了α-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)的位置，并指出了其關(guān)鍵殘基[24-26]。常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，即其結(jié)合位點(diǎn)為酶的活性位點(diǎn)[27-28]。因此，本研究以阿卡波糖為探針，指出α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)。為了獲得白藜蘆醇和α-葡萄糖苷酶最可能的結(jié)合位點(diǎn)，搜索受體蛋白的整個三維空間，包括活性位點(diǎn)和非活性位點(diǎn)區(qū)域。根據(jù)對接打分和計(jì)算獲得的結(jié)合自由能確定白藜蘆醇可能的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算IC50和抑制常數(shù)（Ki），通過線性擬合作Lineweaver-Burk圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活性的影響

不同濃度的白藜蘆醇和阿卡波糖在與α-葡萄糖苷酶孵育后以劑量依賴性方式抑制酶活性。在白藜蘆醇濃度大于100 μmol/L時(shí)α-葡萄糖苷酶活力較低，對其抑制效果較強(qiáng)，IC50為5.047 μmol/L，明顯強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖（632.6 μmol/L），表明白藜蘆醇可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶活力（圖1）。

圖1 白藜蘆醇和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig. 1 Effect of resveratrol and acarbose on the activity of α-glucosidase

2.2 抑制動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，白藜蘆醇濃度越大斜率越大，即vmax減小，而所有直線與x軸幾乎相交于一點(diǎn)，即Km基本不變，表明白藜蘆醇介導(dǎo)的α-葡萄糖苷酶抑制遵循非競爭性抑制機(jī)制。以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，雙倒數(shù)圖中不同直線的斜率（vmax/Km）為縱坐標(biāo)，則直線與x軸相交于Ki，非線性擬合結(jié)果顯示Ki為5.743 μmol/L。因此，白藜蘆醇可以直接與α-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)附近的區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致vmax改變，而Km不變。

圖2 白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)Fig. 2 Inhibition kinetics of resveratrol on α-glucosidase

2.3 同源建模結(jié)果

序列比對完成后，選擇一致性程度較高（72.51%）、蛋白解析精度也較高的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶（蠟樣芽孢桿菌）作為模板蛋白，蛋白數(shù)據(jù)庫編號為3aj7。PROCHECK是一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證的程序，通過繪制拉氏圖判斷蛋白結(jié)構(gòu)的合理性。如圖3所示，98.8%的氨基酸落于合理區(qū)，因此所構(gòu)建模型質(zhì)量較高，可以用于分子對接模擬。

圖3 α-葡萄糖苷酶模型的拉氏圖Fig. 3 Ramachandran plot of α-glucosidase model

2.4 結(jié)合模式分析結(jié)果

圖4 為阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的對接結(jié)果，表明其結(jié)合位點(diǎn)的位置。半透明區(qū)域表明阿卡波糖及其與α-葡萄糖苷酶相互作用殘基的溶劑可及表面，表面顏色由距離表面最近的原子電荷性質(zhì)決定，表示阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)，即酶的活性位點(diǎn)。和一些研究結(jié)果[18]類似，對接結(jié)果表明His111、Phe177、Arg212、Asp214、Glu276、His348、Asp349和Arg439等氨基酸殘基和阿卡波糖相互作用形成氫鍵、范德華力等作用力，對于阿卡波糖的抑制活性有著重要的作用。

將白藜蘆醇與α-葡萄糖苷酶的所有空腔進(jìn)行對接并計(jì)算結(jié)合能。由于白藜蘆醇結(jié)構(gòu)比較簡單，可以對接結(jié)合的位點(diǎn)很多，但許多位點(diǎn)的得分和結(jié)合能較低。因此選擇3 個得分和結(jié)合能都較高的位點(diǎn)進(jìn)行研究（表1）。

圖4 α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式Fig. 4 Binding modes of α-glucosidase

表1 白藜蘆醇與α-葡萄糖苷酶的對接得分及其結(jié)合能Table 1 Docking scores and binding energy of resveratrol with α-glucosidase

圖5 3 種白藜蘆醇與α-葡萄糖苷酶可能的結(jié)合模式Fig. 5 Three probable binding modes of resveratrol with α-glucosidase

如圖5所示，所有結(jié)合位點(diǎn)都位于α-葡萄糖苷酶的非競爭性結(jié)構(gòu)域，而不是活性位點(diǎn)上。因此，白藜蘆醇是α-葡萄糖苷酶的非競爭性抑制劑，對接結(jié)果符合抑制動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3 個結(jié)合位點(diǎn)都遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)，其中site 1距離活性位點(diǎn)最近（圖4b），但活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基均不參與其結(jié)合模式，表明白藜蘆醇不會與底物（pNPG）競爭結(jié)合活性位點(diǎn)。

白藜蘆醇作為多羥基芪類化合物，其羥基與酶的氨基酸殘基發(fā)生氫鍵相互作用，這在3 種結(jié)合模式中均有體現(xiàn)（圖5）。例如，在結(jié)合位點(diǎn)site 1中白藜蘆醇的羥基與關(guān)鍵殘基Asp132、Try136、Glu187形成氫鍵，在site 2中與關(guān)鍵殘基Asp360、Try399、Try404形成氫鍵，在site 3中與關(guān)鍵殘基Arg175、Asn411形成氫鍵。其中，本研究中site 1的關(guān)鍵殘基與Liu Yan等[29]關(guān)于α-葡萄糖苷酶非競爭結(jié)合域的研究中指出的多個關(guān)鍵殘基相同。無論是得分還是結(jié)合能，3 個位點(diǎn)的結(jié)果都非常相近，因此都不能完全排除。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中酶動力學(xué)的研究表明白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用，遵循典型的非競爭性抑制機(jī)制，使得vmax減小，而Km不變。這表明白藜蘆醇與酶的結(jié)合位點(diǎn)處于非競爭結(jié)構(gòu)域而不在活性位點(diǎn)。之前的一些研究表明，非競爭性抑制劑與競爭性抑制劑之間，甚至非競爭性抑制劑之間[29-30]存在著協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。目前，作為II型糖尿病的一線藥物，阿卡波糖、伏格列波糖等都是α-葡萄糖苷酶的競爭性抑制劑。因此，作為非競爭性抑制劑，白藜蘆醇也具有與阿卡波糖等一線藥物聯(lián)用的潛力。

計(jì)算模擬研究中獲得了白藜蘆醇與α-葡萄糖苷酶3 種可能的結(jié)合模式。和之前對多羥基化合物的研究相同，在所有結(jié)合模式中氫鍵相互作用都扮演了十分重要的角色[31]。3 個非競爭性結(jié)構(gòu)域均遠(yuǎn)離酶活性位點(diǎn)，不含有與阿卡波糖結(jié)合的殘基。因此，其有很大可能與阿卡波糖產(chǎn)生協(xié)同作用。

綜上所述，本研究通過酶動力學(xué)和計(jì)算模擬方法對白藜蘆醇與α-葡萄糖苷酶的相互作用進(jìn)行研究，揭示其可能的結(jié)合機(jī)制。白藜蘆醇具有很強(qiáng)的酶抑制能力，屬于非競爭性抑制。從機(jī)理上說，白藜蘆醇并不會影響阿卡波糖的降血糖效果。相反，其與阿卡波糖聯(lián)合使用可能會展現(xiàn)更好的效果。今后的研究將重點(diǎn)關(guān)注利用基因定點(diǎn)突變、體外酶表達(dá)和分離等分子技術(shù)結(jié)合酶動力學(xué)方法，更深入地探究白藜蘆醇和α-葡萄糖苷酶的相互作用，從而改造和開發(fā)相關(guān)α-葡萄糖苷酶抑制劑。