李佳會(huì),郭 斌,劉亞明,甄亞男,王 穎,霍 強(qiáng),劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通訊作者,E-mail:620793985@qq.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一個(gè)系統(tǒng)性的自身免疫性疾病,以對(duì)稱性、破壞性、慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征,炎性滑膜主要由類風(fēng)濕成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(rheumatoid fibroblast-like synoviocytes,RAFLS)組成并積極參與關(guān)節(jié)炎癥和進(jìn)展[1]。RA表現(xiàn)出一種侵略性的/轉(zhuǎn)化的表型,通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨損傷[2]。關(guān)節(jié)破壞的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但與免疫、炎癥等因素密切相關(guān)。治療藥物中除了包含傳統(tǒng)緩解病情的抗風(fēng)濕藥物(DMARD)外,也包括生物制劑及靶向小分子治療藥物等。雖然RA的治療有所改善,但目前可用的疾病調(diào)節(jié)藥物并不直接靶向FLS功能障礙。因此,新的合理的設(shè)計(jì)需要疾病調(diào)節(jié)劑來代替或補(bǔ)充目前的療法。對(duì)RA的研究主要是利用免疫學(xué)、遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù),但糖代謝對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的影響迄今尚未得到重視[3,4]。近年來,一些研究結(jié)果表明,糖代謝在RA的發(fā)病機(jī)制中起著舉足輕重的作用。在葡萄糖代謝中,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glucose transporters-1,GLUT-1)是一種單一轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖蛋白,是各種組織攝取葡萄糖的最基本蛋白,因此,GLUT-1與很多代謝失調(diào)的疾病有關(guān)[5]。文獻(xiàn)表明,RAFLS細(xì)胞中GULT1表達(dá)上升,且GLUT1的表達(dá)量與RA的嚴(yán)重程度成正比[6]。STF-31是一種特異性靶向GLUT-1抑制劑,能夠完全抑制葡萄糖的攝取活性,具有合成致死活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且同樣可通過降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)來降低糖酵解[6]。而STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)旨在研究STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的增殖及凋亡的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基與胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司,胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技公司,STF-31購(gòu)自Selleck中國(guó),MTT購(gòu)自Sigma公司,Bcl-2、Bax、Akt、β-actin等抗體購(gòu)自Proteintech公司,HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自博士德生物工程公司,ATP檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自碧云天公司。

1.2 細(xì)胞株

RAFLS購(gòu)自BNCC細(xì)胞庫(kù)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAFLS細(xì)胞株制成終濃度為6×103/ml的單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,100 μl/孔,置于37 ℃,5% CO2,在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h。吸去原培養(yǎng)液,加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑STF-31處理細(xì)胞,24 h,48 h,72 h各加入15 μl的MTT溶液(5 mg/ml)。4 h吸去上清,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min待甲臜完全溶解,在490 nm波長(zhǎng)處用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值(OD490 nm)。計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD490 nm/對(duì)照組OD490 nm×100%。取均值繪制藥物劑量效應(yīng)曲線并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。重復(fù)3次取平均值。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ATP水平檢測(cè)

將RAFLS細(xì)胞接種于12孔板中(1×105個(gè)/孔),培養(yǎng)18-24 h,待細(xì)胞匯合達(dá)70%時(shí),加入不同濃度STF-31(0,2,4,8 μmol/L)處理。6 h時(shí),收集細(xì)胞,離心,棄上清,每孔細(xì)胞加入50 μl裂解液,彈擊管底使細(xì)胞充分裂解。使用4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心30 min,取上清用于后續(xù)測(cè)定(冰上操作)。用BCA蛋白定量法定量。在檢測(cè)孔中加入事先配好的ATP檢測(cè)工作液(1 ∶9),每孔100 μl,室溫放置5 min,使本底性ATP全部消耗(避光操作)。每孔加30 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.5 JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位差

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAFLS細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,接種于12孔培養(yǎng)板,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h時(shí)加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑STF-31(0,2,4,8 μmol/L),48 h時(shí),吸除原培養(yǎng)液,PBS溶液洗滌細(xì)胞1次,加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加入1 ml JC-1染色工作液,充分混勻,細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。在孵育期間,配制適量的JC-1染色緩沖液(1×),按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例,并放置于冰浴。孵育結(jié)束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗2次。加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 雙染法分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAFLS細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,接種于6孔培養(yǎng)板,每孔2×105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h時(shí)加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑STF-31,24 h時(shí)收集細(xì)胞,用PBS洗兩次,1 200 r/min離心5 min,加入500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入10 μl Annexin-Ⅴ-FITC混勻后,室溫避光反應(yīng)15 min,再加入5 μl PI染液,1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Akt的表達(dá)

將RAFLS細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h時(shí),加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑STF-31處理。處理48 h時(shí),消化并收集細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗2次,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入預(yù)冷的蛋白裂解液,冰上裂解30 min,提取細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白定量法測(cè)定各組蛋白濃度。每組取50-90 μg蛋白,SDS-PAGE電泳(70 V,400 mA,50 W,30 min;90 V,400 mA,50 W,90 min);轉(zhuǎn)膜(50 V,200 mA,150 min)至PVDF膜;5%脫脂牛奶室溫封閉4 h;一抗室溫孵育過夜;TPBS洗膜3次;二抗室溫孵育2 h;TPBS洗膜3次;ECL發(fā)光試劑盒顯影;Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT檢測(cè)結(jié)果表明,隨著STF-31濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的增殖抑制作用增加(見圖1)。作用24,48,72 h的IC50值分別為9.96,1.38,0.501 μmol/L,與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與0 μmol/L比較,* P<0.05圖1 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的增殖抑制作用Figure 1 STF-31 inhibits the proliferation of RAFLS cells

2.2 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度的STF-31作用于RAFLS細(xì)胞48 h,在鏡下可見,對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞間連接緊密,細(xì)胞呈梭形,胞膜清楚,胞質(zhì)飽滿,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度減低,無懸浮細(xì)胞,細(xì)胞間隙增寬(見圖2),與空白對(duì)照組細(xì)胞相比給藥組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,形態(tài)無明顯變化。

2.3 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響

STF-31作用于RAFLS細(xì)胞6 h,與空白對(duì)照(0 μmol/L)比較,2,4,8 μmol/L STF-31均可明顯降低RAFLS細(xì)胞內(nèi)的ATP水平(P<0.05,見圖3),并隨著STF-31濃度增加,RAFLS細(xì)胞內(nèi)的ATP水平顯著降低。

圖2 不同濃度STF-31作用48 h對(duì)RAFLS細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 2 Effect of STF-31 on the morphology of RAFLS cells at 48 h

與0 μmol/L比較,* P<0.05圖3 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞的ATP含量的影響Figure 3 Effect of STF-31 on ATP content in RAFLS cells

2.4 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1熒光出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常,細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常;出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降,并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。2,4,8 μmol/L STF-31作用48 h均可明顯降低RAFLS細(xì)胞的線粒體膜電位水平(見圖4),提示STF-31可誘導(dǎo)RAFLS細(xì)胞線粒體膜電位下降。

2.5 STF-31對(duì)RA-FLS細(xì)胞總的細(xì)胞凋亡的影響

濃度為2,4,8 μmol/L的STF-31處理RAFLS細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率結(jié)果顯示,空白對(duì)照組的總的細(xì)胞凋亡率為(9.12 ±0.6)%;2,4,8 μmol/L的STF-31可誘導(dǎo)RAFLS細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡(見圖5),總的細(xì)胞凋亡率分別為(16.07 ±2.3)%,(19.56 ±2.7)%,(30.2 ±2.6)%,與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞Bcl-2,Bax,Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明,STF-31可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2、p-Akt的表達(dá),同時(shí)上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)(見圖6)。

圖4 不同濃度STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞線粒體膜電位的影響 (bar=50 μm)Figure 4 Effect of STF-31 on mitochondrial membrane potential in RAFLS cells (bar=50 μm)

圖5 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of STF-31 on total apoptosis of RAFLS cells

圖6 STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞Bcl-2,Bax,p-Akt蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of STF-31 on the expression of Bcl-2, Bax and p-Akt proteins in RAFLS cells

3 討論

正常FLSs細(xì)胞主要以有氧代謝提供能量,相比有氧氧化,糖酵解是一種低效率的產(chǎn)能方式。RAFLS細(xì)胞中,作為糖酵解途徑主要酶的甘油醛3-磷酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性水平升高,表明RAFLS細(xì)胞的糖酵解活性增加[7]。質(zhì)子磁共振波譜(MRS)研究了RA滑液的組成,檢測(cè)到乳酸顯著升高,葡萄糖濃度降低,同樣證實(shí)RA滑液中糖酵解活性增加[8]。炎癥關(guān)節(jié)的微環(huán)境也表現(xiàn)為缺氧和低濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。缺氧和細(xì)胞因子刺激顯著增加了糖酵解[10,11]。低氧條件誘導(dǎo)HIF1表達(dá),從而誘導(dǎo)GLUT1表達(dá)[12]。GLUT1的表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致葡萄糖攝取增加、細(xì)胞增殖活化,進(jìn)而加重病程。

STF-31是一種特異性靶向GLUT1抑制劑,可以特異性與GLUT1結(jié)合抑制葡萄糖攝取,從而抑制糖酵解。已有研究表明,STF-31能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、子宮頸腺癌、頭頸癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤[13]、骨髓瘤[14]及von Hippel-Lindau(VHL)缺陷腎癌細(xì)胞[15]中葡萄糖的攝取進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為驗(yàn)證STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞是否同樣有較好的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用進(jìn)行MTT,Annexin-Ⅴ-FITC雙染法和JC-1染色，結(jié)果表明STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞有明顯的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子Bcl-2家族蛋白,包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導(dǎo)蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等[16]。凋亡抑制蛋白具有保持線粒體膜的完整性的功能,而凋亡誘導(dǎo)蛋白能夠促使凋亡因子如細(xì)胞色素C、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子、第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑等的釋放,最終通過激活caspase激酶而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。Akt(又稱作蛋白激酶B或PKB)作為一種原癌基因,在調(diào)控代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中觀察到,2,4,8 μmol/L STF-31處理RAFLS細(xì)胞48 h,可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2及p-AKT的表達(dá),而上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá),從而增加線粒體膜的通透性以及凋亡因子的釋放而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

鑒于STF-31能夠抑制VHL缺乏的RCC細(xì)胞葡萄糖的攝取和ATP的產(chǎn)生誘導(dǎo)其凋亡,同時(shí)RCC腫瘤種植小鼠模型中顯示,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞死亡。ATP結(jié)果顯示STF-31同樣可以降低RAFLS細(xì)胞內(nèi)ATP水平。

由于GLUT受體在正常組織中的普遍表達(dá),在較高劑量下可能導(dǎo)致全身毒性,然而,在低劑量下,STF-31具有通過消耗ATP和下調(diào)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而增強(qiáng)化學(xué)增敏作用,但具有較小毒性。因此,在較低劑量下,STF-31可與細(xì)胞毒性藥物合用來預(yù)防和治療化學(xué)耐藥性[18]。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證明,STF-31對(duì)RAFLS細(xì)胞增殖抑制且可以誘導(dǎo)RAFLS細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是RAFLS細(xì)胞通過引起細(xì)胞內(nèi)ATP降低、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、p-Akt的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)通過抑制葡萄糖代謝來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,靶向代謝途徑是理解這一問題疾病的機(jī)制。抑制葡萄糖代謝可直接調(diào)節(jié)RAFLS細(xì)胞的能量代謝而介導(dǎo)炎癥功能,可能是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效治療策略。