敬曉鵬,保森竹

(1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科,青海 810000;2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科)

神經(jīng)病理性痛(neuropathic pain,NP)是軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病所致疼痛[1]。研究資料顯示,一般人群的神經(jīng)病理性疼痛患病率高達8.0%。據(jù)報道,我國目前神經(jīng)病理性疼痛的患者約有9 000萬,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。NP病因很多,發(fā)病機制復(fù)雜,至今尚不完全明確。γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic acid,GABA)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮生理作用[3]。阿魏酸(feralic acid,FA)是當(dāng)歸、川芎等中藥中主要有效單體成分,其鈉鹽為阿魏酸鈉片,商品名為川芎素(sodium ferulate,SF),SF具有增強造血機能、抗凝血、抗心肌缺血、抗輻射損傷等作用,臨床上主要用于偏頭痛、血管性頭痛、冠心病、心血管疾病等的治療[4]。本研究采用坐骨神經(jīng)結(jié)扎慢性損傷法復(fù)制大鼠神經(jīng)病理性痛模型,同時予以不同濃度川芎素進行干預(yù),觀察其對NP的保護作用及對GABA信號通路的影響,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠,雄性40只,體質(zhì)量210-230 g,由本院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)1周待適應(yīng)環(huán)境后實驗,所有實驗大鼠的飼養(yǎng)管理及使用嚴格按照動物保護學(xué)會有關(guān)規(guī)定進行。

1.2 主要試劑和儀器

3%戊巴比妥鈉,購自青島捷世康生物科技有限公司,批號:HXSJ-021231;川芎素(純度≥98%,國藥準(zhǔn)字H51023583),購自成都亨達藥業(yè)有限公司;Trizol試劑,購自大連寶生物工程有限公司;AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京vazyme生物公司;miScript SYBR?Green qPCR Kit購自德國QIAGEN公司;一抗兔源GABA抗體、GADD抗體、GAT1抗體、β-actin抗體、二抗羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司;Von Frey test觸覺測量套件(機械刺痛),購自天津儀數(shù)科技有限公司;熱刺痛儀,購自上海軟隆科技發(fā)展有限公司;冷熱板測痛儀,購自上海豫研科學(xué)儀器有限公司;qRT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成;紫外分光光度計,購自美國Thermo公司;qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷(CCI)模型制備 參照王東輝等[1]方法制備CCI模型:SD大鼠取右側(cè)臥位固定,腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.1-0.2 ml/100 g進行麻醉,碘伏消毒大鼠右側(cè)后肢,切開右后肢皮膚,鈍性分離肱骨中段坐骨神經(jīng)的神經(jīng)干,由近心端向遠心端依次每隔相距1 mm用3.0絲線輕度結(jié)扎4個結(jié),直至神經(jīng)外鞘膜稍微受壓為宜,打結(jié)時可見肢體輕微抽搐,結(jié)扎大鼠坐骨神經(jīng)可見其左側(cè)后爪內(nèi)斂,后爪輕度外翻和跛行。假手術(shù)組鈍性分離暴露坐骨神經(jīng)但不進行結(jié)扎。術(shù)后大鼠均放回動物房細心護理,每日肌肉注射4萬U青霉素,連續(xù)3 d,防止手術(shù)繼發(fā)感染。

1.3.2 實驗分組 將SD大鼠隨機分為5組,每組8只:假手術(shù)組(S組),慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷模型對照組(CCI組),川芎素(SF)給藥組。川芎素給藥組分別按照50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg SF(低、中、高劑量SF用0.9%的生理鹽水溶解)腹腔注射[4]。S組和CCI組均腹腔注射0.9%生理鹽水,注射體積為10 ml/kg。各組小鼠從造模后第8天開始給藥(或生理鹽水),每天1次,連續(xù)給藥1周。

1.3.3 機械刺激縮足反射閾值的測定 分別于造模前1 d,造模后7 d,給藥后1,3,5,7 d,將各組大鼠置于透明有機玻璃箱中(20 cm×12 cm×20 cm)限定其活動區(qū)域,箱底放置0.5 cm×0.5 cm網(wǎng)格鐵絲網(wǎng),使其適應(yīng)15 min后,測定大鼠機械刺激縮足反射閾值。測定方法:用不同彎折力的Von Frey Filaments(vFFs)纖維絲分別刺激大鼠足底皮膚,維持5 s左右,每次刺激至少間隔15 s,待上一次刺激引起的行為反射消失后再進行下一次刺激,刺激后觀察大鼠反應(yīng),當(dāng)大鼠出現(xiàn)明顯的縮足、舔足或抖足動作時,視為陽性反應(yīng),否則視為無反應(yīng),另外vFFs彎折90°時,大鼠仍不縮足,也視為無反應(yīng)。彎折力最大值為15 g,超過15 g者均按15 g計算,記錄每只大鼠折力值,即為機械縮足反射閾值(g)。

1.3.4 熱縮足反射潛伏期的測定 分別于造模前1 d,造模后7 d,給藥后1,3,5,7 d,采用1.3.2方法限定大鼠活動范圍,箱底放置3 mm厚玻璃板,適應(yīng)15 min后,使用熱刺痛儀測定大鼠熱縮足反射潛伏期。將熱刺痛儀熱光源照射大鼠足底,從打開光源至大鼠出現(xiàn)抬足或縮足反應(yīng)的時間記為縮足反射潛伏期(s)。設(shè)定光照時間最長為15 s,刺激溫度為30 ℃,避免刺激過程中大鼠燙傷,連續(xù)測定3次取平均值,每次間隔15 min。

1.3.5 冷縮足反射閾值測定 分別于造模前1 d,造模后7 d,給藥后1,3,5,7 d,采用上述1.3.2方法同樣有機玻璃箱限定大鼠活動范圍,箱底表面溫度為(4 ±1)℃冷玻璃板,使其適應(yīng)5 min后,記錄接下來5 min內(nèi)大鼠結(jié)扎后肢抬足、抖足或舔足次數(shù)記為冷縮足反射閾值。

1.3.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測大鼠脊髓組織中GABA通路相關(guān)基因表達 末次給藥24 h后,將每組8只大鼠均脫臼處死,取腰膨大處(L4/5節(jié)段)脊髓,迅速放入研缽中,液氮冷凍后充分研磨,用Trizol試劑提取總RNA,再依次進行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗,引物見表1,操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。qRT-PCR采用10 μl體系:cDNA(50 ng/μl)1 μl,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ddH2O 8.0 μl。反應(yīng)條件為:95 ℃ 90 s,95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法分析脊髓組織中GABA、GAD、GAT1基因mRNA相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.3.7 Western blot(WB)檢測大鼠脊髓組織中GABA通路相關(guān)蛋白表達 末次給藥24 h后,按照1.3.6方法將大鼠脫臼處死,取腰膨大處(L4/5節(jié)段)脊髓組織,加入裂解液,提取蛋白置于-80 ℃?zhèn)溆?。蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定。加入1/5體積6×SDS上樣緩沖液,95 ℃ 5 min,冷卻離心后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 mg蛋白樣品行10% SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入GABA GAT1抗體(1 ∶1 000)、GAD抗體(1 ∶1 000)、β-actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜3次,每次20 min,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(1 ∶3 000)室溫孵育45 min,按上述方法洗膜,用免疫印記化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色,數(shù)字化多功能圖像增強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝片,觀察結(jié)果并進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 川芎素對CCI大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

各組大鼠造模前機械刺激縮足反射閾值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后7 d,與假手術(shù)組比較,CCI組和50,100,200 mg/kg川芎素治療組大鼠機械刺激縮足反射閾值顯著降低(P<0.05);給藥后,與CCI模型組比較,各時間點50,100,200 mg/kg川芎素治療組大鼠機械縮足反射閾值顯著升高(P<0.05,見表2),而且給藥后1 d 100 mg/kg與50 mg/kg組、200 mg/kg與100 mg/kg組、200 mg/kg與50 mg/kg組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后3,5,7 d時50 mg/kg與200 mg/kg比較,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 川芎素對CCI大鼠熱縮足反射潛伏期的影響

各組大鼠造模前熱縮足反射潛伏期比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后7 d,與假手術(shù)組比較,CCI組和川芎素治療組熱縮足反射潛伏期顯著降低(P<0.05);給藥后,與CCI模型組比較,各時間點川芎素各治療組大鼠熱縮足反射潛伏期顯著升高(P<0.05,見表3)。

2.3 川芎素對CCI大鼠冷縮足反射閾值的影響

各組大鼠造模前冷縮足反射閾值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后7 d,與假手術(shù)組比較,CCI組和川芎素各治療組冷縮足反射閾值顯著升高(P<0.05);給藥后,與CCI模型組比較,各時間點川芎素各治療組大鼠冷縮足反射閾值顯著降低(P<0.05,見表4)。

表2 川芎素對CCI大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響Table 2 Effect of ligustrazine on the threshold of mechanical stimulation contraction reflex in CCI

與S組比較,*P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05;與50 mg/kg組比較,△P<0.05;與100 mg/kg組比較,★P<0.05

表3 川芎素對CCI大鼠熱縮足反射潛伏期的影響Table 3 Effects of Ligustrazine on latency of thermosystolic foot reflex in CCI

與S組比較,*P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05

表4 川芎素對CCI大鼠冷縮足反射閾值的影響次,n=8)Table 4 Effect of ligustrazine on reflex threshold of cold shrinkage foot in CCI 次,n=8)

與S組比較,*P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05

2.4 川芎素對CCI大鼠脊髓組織GABA通路相關(guān)基因表達的影響

與假手術(shù)組比較,CCI模型組及川芎素各治療組GABA、GAD mRNA明顯偏低,GAT1 mRNA明顯偏高(P<0.05),與CCI組比較,川芎素50,100,200 mg/kg組均可顯著上調(diào)CCI大鼠GABA、GAD mRNA水平,下調(diào)GAT1 mRNA水平(P<0.05,見圖1)。

2.5 川芎素對CCI大鼠脊髓組織GABA通路相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較,CCI組、川芎素200 mg/kg組GABA、GAD蛋白表達水平明顯降低,GAT1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與CCI組比較,川芎素200 mg/kg組GABA、GAD蛋白表達水平顯著上調(diào),GAT1蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05,見圖2)。

與S組比較,* P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05圖1 川芎素對CCI大鼠脊髓組織GABA通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響Figure 1 Relative expression of GABA pathway-related genes in spinal cord of CCI rats after treated with

與S組比較,* P<0.05;與CCI組比較,#P<0.05圖2 川芎素對CCI大鼠脊髓組織GABA通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 2 Effect of ligustrazine on expression of GABA pathway-related protein in spinal cord of CCI rats

3 討論

NP是一種由軀體神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能障礙或疾病等引起的疼痛性疾病[5],其特征主要是自發(fā)痛和誘發(fā)痛[6],臨床表現(xiàn)類型有:痛覺過敏、痛覺超敏、感覺/疼痛異常等[7]。目前臨床常用治療藥物有NMDA拮抗劑、抗抑郁藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥等[8],然而這些藥物針對NP治療的靶向性并不完全明確,且不良反應(yīng)較多,治療具有很大局限性[9]。近來隨著動物模型研究增多,對NP研究也不斷深入,GABA通路被發(fā)現(xiàn)與NP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),GABA異常還與失眠等有關(guān)[10]。因此本研究擬探究川芎素對神經(jīng)病理性痛大鼠模型的作用,以及對GABA通路的影響,以期探究川芎素對神經(jīng)病理性痛大鼠的保護作用機制。

阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一,不溶于水,其鈉鹽阿魏酸鈉即川芎素,性質(zhì)相對穩(wěn)定,溶于水且易合成,在臨床應(yīng)用廣泛[11]。川芎素可直接清除OFR、抗氧化、減少脂質(zhì)過氧化,還具有抑制血小板聚集、減少細胞內(nèi)游離鈣濃度等作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn),川芎素(阿魏酸鈉)可通過調(diào)節(jié)TJ蛋白、MMP-9和AQP4蛋白的表達顯著減輕腦缺血和再灌注后血腦屏障破壞[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎素治療,可上調(diào)神經(jīng)病理性痛大鼠機械刺激反射閾值,延長神經(jīng)病理性痛大鼠熱縮足反射潛伏期,降低神經(jīng)病理性痛大鼠冷縮足反射閾值,提示川芎素對NP具有一定保護作用,但其機制尚不清楚。

GABA是機體一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),正常情況下與興奮性遞質(zhì)(如谷氨酸)處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)GAGB攝取增多或生成減少時,興奮性遞質(zhì)功能會增強,從而引發(fā)疼痛。谷氨酸脫羧酶(GAD)可催化谷氨酸脫羧形成GABA,是GABA合成的關(guān)鍵限速酶[14]。γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運體(GAT)是位于突觸前膜、神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜或囊泡膜上的一種糖蛋白,是突觸信息傳遞的重要調(diào)控因子,能選擇性將GABA從突觸間隙轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)或囊泡中,從而減少GABA的神經(jīng)抑制作用[15,16]。GAT1在其4類亞型中占到80%左右,是GABA的主要轉(zhuǎn)運載體[17]。GAT1對于維持突觸間隙GABA含量起調(diào)節(jié)重要作用,GAT1抑制劑具有鎮(zhèn)痛作用,而GAT1激動劑或過表達則會引起疼痛或痛過敏[17,18]。本研究基于GABA通路對GABA的合成、代謝和轉(zhuǎn)運進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),川芎素治療可顯著增加神經(jīng)病理性痛大鼠GABA、GAD mRNA及蛋白表達水平,下調(diào)GAT1 mRNA及蛋白表達水平,提示川芎素可促進神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓組織中GABA、GAD蛋白表達和抑制GAT1蛋白表達。Dubbioso等[19]研究發(fā)現(xiàn),GABA與神經(jīng)系統(tǒng)紊亂有關(guān),GABA的缺失可增加舞蹈癥的發(fā)病風(fēng)險。諶凌燕等[20]研究報道,GABA對神經(jīng)元有保護作用,升降散可通過抑制NMDAR的磷酸化及提高GABAR mRNA表達水平減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛。綜合以上研究推測,川芎素可能通過上調(diào)GABA通路中GABA、GAD蛋白表達和下調(diào)GAT1蛋白表達,發(fā)揮對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述,川芎素對大鼠慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷神經(jīng)病理性痛有良好的鎮(zhèn)痛作用,其機制可能與上調(diào)GABA通路中GABA、GAD蛋白表達和下調(diào)GAT1蛋白表達有關(guān),具體機制尚有待進一步研究。