郭亞春 李衛(wèi) 黃群 白冰 宋鴻儒 劉翠哲

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2承德監(jiān)獄醫(yī)院；3河北北方學(xué)院)

四氯化碳(CCl4)是一種對肝細胞有嚴重毒性作用的化學(xué)物質(zhì)。誘導(dǎo)肝損傷的主要機制與激活機體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)〔1〕。CCl4肝損傷模型所表現(xiàn)的肝細胞損傷、壞死、纖維化等，與一些臨床常見的酒精肝損傷、病毒肝損傷等類似〔2〕。因此，CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型是目前常用的肝損傷模型之一。黃芩苷是從中藥黃芩中提取出的一種具有清除自由基、抗氧化、抗炎等多種藥理作用的黃酮類化合物。黃芩苷可以通過抗氧化活性對CCl4誘導(dǎo)肝損傷產(chǎn)生保護作用〔3〕，但其水溶性極差，限制了其臨床應(yīng)用。黃芩苷鎂鹽為黃芩苷在中藥黃芩中的原本存在形式，其水溶性極好〔4〕。本研究通過建立CCl4誘導(dǎo)SD大鼠急性肝損傷模型，尾靜脈注射不同濃度的黃芩苷鎂鹽，探討黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護作用及有效的藥物治療濃度。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠80只，實驗起始體重150～170 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；所有動物于清潔級動物室飼養(yǎng)，自由飲食，定時換氣，室內(nèi)溫度(22±2)℃，室內(nèi)濕度為70%，每日光照10 h。

1.2藥物 黃芩苷鎂鹽(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲教授課題組提供，純度93.1%)；CCl4(購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；異甘草酸鎂注射液(購于正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司)。

1.3實驗儀器與試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(美國thermo公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。721N可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Leica RM2235石蠟切片機(德國Leica儀器公司)；酶標儀(加拿大Biotek公司)。

1.4實驗方法

1.4.1動物分組與造模 實驗分為正常對照組、模型組、陽性對照組〔異甘草酸鎂，18 mg/(kg·d)〕及黃芩苷鎂鹽Ⅰ〔12.5 mg(kg·d)〕、Ⅱ〔25.0 mg/(kg·d)〕、Ⅲ〔50.0 mg/(kg·d)〕、Ⅳ〔100.0 mg/(kg·d)〕、Ⅴ〔200.0 mg/(kg·d)〕組，每組10只，尾靜脈連續(xù)給藥1 w。正常對照組與模型組每天尾靜脈注射等體積的無菌生理鹽水。末次給藥2 h后，除正常對照組腹腔注射等體積的橄欖油外，其余各組按1 ml/kg腹腔注射50%的CCl4溶液進行模型制備。

1.4.2血生化指標檢測 各組大鼠腹主動脈取血，置于冰上，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取血清樣本，送承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST活性。

1.4.3肝臟病理組織切片觀察 各組大鼠均取肝左大葉的相同部位組織以10%中性甲醛固定24 h，切取約3 mm厚的組織置于全自動脫水機中常規(guī)脫水，包埋，行4 μm厚度連續(xù)切片，然后常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，封片，光鏡下檢查各組大鼠肝組織損傷情況。

1.4.4肝組織勻漿檢測 按南京建成生物工程研究所肝組織勻漿制備說明書制備10%肝組織勻漿，BCA法測定肝組織勻漿蛋白濃度。按MDA測定試劑盒說明，配制標準管、空白管、測定管、對照管，應(yīng)用硫代巴比妥酸法測定各組大鼠肝組織受自由基攻擊的嚴重程度。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 整個實驗過程中各組大鼠的體重均有所增加，與正常對照組相比，模型組大鼠體重較輕，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛色黯淡，毛質(zhì)粗糙。黃芩苷鎂鹽各組與異甘草酸鎂組大鼠的上述情況均有所改善。

2.2各組大鼠血ALT、AST活性的變化情況 與正常對照組相比，模型組ALT、AST水平顯著增高(P<0.01)。與模型組相比，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組ALT、AST水平均顯著降低(P<0.05)。與陽性對照組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組黃芩苷鎂鹽ALT水平均顯著降低(P<0.05)，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組AST水平與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3肝組織病理學(xué)改變 正常對照組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，胞質(zhì)染色均勻，鏡下可清晰看到完整的細胞核。模型組肝細胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，細胞間隙變大，胞質(zhì)染色不均，胞質(zhì)間可見明顯脂滴，出現(xiàn)明顯的氣球樣變，細胞核出現(xiàn)偏移、固縮。黃芩苷鎂鹽Ⅰ、Ⅱ組肝細胞間隙的破壞和氣球樣變較模型組有所改善，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝細胞結(jié)構(gòu)的破壞有明顯改善。陽性對照組較模型組的病理損傷也具有明顯改善。見圖1。

2.4肝組織勻漿中MDA含量的變化 與正常對照組相比，模型組肝組織MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性對照組與黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均顯著降低肝組織中MDA水平(P<0.05)。與陽性對照組相比，黃芩苷鎂鹽Ⅳ、Ⅴ組MDA降低水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，見表1。

表1 各組ALT、AST 及MDA水平變化情況

與正常組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.05;3)P<0.01;與陽性組比較:4)P<0.05;5)P<0.01

正常對照組

模型組

陽性對照組

黃芩苷鎂鹽Ⅳ組

3 討 論

急性肝損傷是由多種因素共同參與所導(dǎo)致的一種復(fù)雜的病理過程。長期肝損傷最終可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等疾病的發(fā)生。因此，深入研究和探討急性肝損傷的發(fā)病機制及有效治療措施，對肝臟疾病的防治具有重要意義。CCl4急性肝損傷模型是用于保肝藥物篩選的經(jīng)典模型之一〔5〕。CCl4在體內(nèi)經(jīng)肝細胞微粒體中的細胞色素P450 酶系代謝，其代謝產(chǎn)物Cl·和CCl3·可大量消耗機體超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽等抗氧化物，致使機體發(fā)生氧化應(yīng)激〔6〕，從而引起肝微粒體及肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化等一系列的連鎖反應(yīng)，致使肝細胞膜被破壞，導(dǎo)致肝細胞的變性及壞死〔6,7〕。

ALT和AST主要存在于肝細胞胞質(zhì)中，當肝細胞膜破裂時，血清中的ALT及AST水平將明顯升高，因此，ALT和AST是反映肝細胞損傷的重要指標。MDA是組織細胞生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后的產(chǎn)物，肝組織中的MDA 水平不僅可以反映肝臟細胞生物膜的脂質(zhì)過氧化水平，還可以反映肝臟疾病嚴重程度〔8〕。因此本研究將大鼠血清中ALT、AST及肝組織中MDA水平作為反映肝損傷的指標。研究顯示CCl4造模后大鼠血清中ALT、AST及肝組織中MDA水平較正常對照組顯著升高，提示急性肝損傷大鼠模型制備成功。應(yīng)用不同濃度的黃芩苷鎂鹽尾靜脈注射預(yù)防后，大鼠血清ALT、AST水平下降，并隨黃芩苷鎂鹽劑量的升高，ALT、AST的下降水平愈加顯著，尤其以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽效果顯著，說明黃芩苷鎂鹽具有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，而這種作用與其藥物濃度有關(guān)，具有一定的劑量依賴性。檢測肝組織MDA水平發(fā)現(xiàn)黃芩苷鎂鹽尾靜脈注射預(yù)防后，黃芩苷鎂鹽可以降低MDA水平，也以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽效果顯著，說明黃芩苷鎂鹽可以通過拮抗肝臟細胞生物膜的脂質(zhì)過氧化水平，進而保護肝臟細胞，其效果也與其藥物濃度有關(guān)，具有一定的劑量依賴性。肝組織病理學(xué)檢查顯示，應(yīng)用黃芩苷鎂鹽預(yù)防后，肝細胞結(jié)構(gòu)的破壞有明顯改善，氣球樣變明顯減輕，其檢查結(jié)果與血清肝功能及肝組織的MDA檢查結(jié)果相一致。以上研究結(jié)果綜合說明黃芩苷鎂鹽對CCl4急性肝損傷大鼠具有良好的預(yù)防保護作用，并且黃芩苷鎂鹽對CCl4急性肝損傷大鼠的保護作用具有一定的劑量依賴性。

異甘草酸鎂是肝細胞的一種保護劑，能夠抗炎、改善肝功能、保護肝細胞膜。研究表明異甘草酸鎂對D-氨基半乳糖引起的急性肝損傷具有防治作用，能減輕肝細胞壞死、炎細胞浸潤，其機制可能與異甘草酸鎂抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護機體抗氧化酶活性，提高肝細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)〔9〕。異甘草酸鎂對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷具有治療效果，可以改善肝功能，減輕纖維化程度，其機制可能與異甘草酸鎂下調(diào)脯氨酰羥化酶的活性，減少膠原合成；降低一氧化氮(NO)水平，抑制CCl4引起的氧化性肝損傷有關(guān)〔10〕。異甘草酸鎂對于免疫性肝損傷也具有一定的保護作用，因此本研究選用異甘草酸鎂作為陽性對照藥物。研究結(jié)果顯示，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽對ALT的降低作用明顯優(yōu)于異甘草酸鎂組，而對于AST的降低作用12.5 mg/kg、25.0 mg/kg的黃芩苷鎂鹽不及異甘草酸鎂，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽與異甘草酸鎂無明顯區(qū)別。檢測MDA水平發(fā)現(xiàn)，12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50.0 mg/kg的黃芩苷鎂鹽不及異甘草酸鎂降低明顯，結(jié)合病理學(xué)檢查結(jié)果，只有黃芩苷鎂鹽達到100.0 mg/kg，其對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷保護作用才可與異甘草酸鎂相一致。因此，黃芩苷鎂鹽100.0 mg/(kg·d)可以作為治療CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷用藥劑量。