肖艷 丁婷

骨肉瘤是未成熟骨組織或惡性增生間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的骨樣組織構(gòu)成的惡性腫瘤，多發(fā)生在20歲以下的兒童或青少年，占兒童腫瘤的5%，惡性程度高，危害嚴(yán)重，死亡率較高[1～3]。臨床上，骨肉瘤的治療主要以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但其對(duì)化療和放療敏感性較低，尚未有特效治療方法，臨床治療效果欠佳。甲氨蝶呤（MTX）是國(guó)家批準(zhǔn)的治療骨肉瘤的一線化療藥，具有較好效果，但隨著耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，其療效也逐漸降低[4，5]。異環(huán)磷酰胺是1988年12月獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)主要適用于軟組織腫瘤、睪丸腫瘤、惡性淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌及兒童腫瘤的化療藥物[6，7]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)中探討甲氨蝶呤聯(lián)合異環(huán)磷酰胺對(duì)骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采用人骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS，購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；甲氨蝶呤（MTX）、異環(huán)磷酰胺（IFO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，并按照說明書融于對(duì)應(yīng)的液相中。DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)買于Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Gibco 公司，并使用DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清按照9∶1的比例配置成含10%血清的培養(yǎng)基以培養(yǎng)細(xì)胞?；酋Ａ_丹明（SRB）購(gòu)買于Sigma 公司，Annexin V 凋亡試劑盒購(gòu)買于賽默飛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U2-OS 細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%的CO2，溫度37℃。細(xì)胞密度達(dá)到90%后按照1∶3 進(jìn)行傳代，一般情況下一周可傳2～3 代。

1.2.2 SRB 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別使用MTX和IFO作用于U2-OS 細(xì)胞系，計(jì)算出U2-OS 細(xì)胞對(duì)MTX和IFO的半抑制濃度（IC50）值。然后按不同用藥方法分為異環(huán)磷酰胺（IFO）組、甲氨蝶呤（MTX）組、甲氨蝶呤聯(lián)合異環(huán)磷酰胺（MTX+IFO）組，IFO和MTX使用半抑制濃度值濃度，比較各組細(xì)胞的細(xì)胞活性并繪制生長(zhǎng)曲線。具體實(shí)驗(yàn)方法：①收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度并按照上述分組接種于96 孔板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔；②細(xì)胞培養(yǎng)24h 后，各組分別加入含有對(duì)應(yīng)藥物及濃度的培養(yǎng)基，組別周邊使用PBS 進(jìn)行封板，防止邊緣效應(yīng)產(chǎn)生；③細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后終止，每孔去上清液，并加入200μl 濃度為10%的三氯乙酸溶液（TCA），4℃固定50min；④使用蒸餾水連續(xù)洗板5次，室溫晾干；⑤每孔加入100μl 磺酰羅丹明（SRB）染液，室溫下染色30min；⑥棄染液，使用濃度為1%的冰乙酸洗板5次，確保洗去浮色后室溫下避光晾干；⑦每孔加入150μl 濃度為10mM的Trisbase 溶液，室溫條件下于搖床高速震蕩15min，使孔內(nèi)SRB染液結(jié)晶完全溶解；⑧使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為515nm處測(cè)定96 孔板各孔的OD 值。

1.2.3 凋亡實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)期U2-OS 細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液密度，分為對(duì)照組、IFO組、MTX組、MTX+IFO組，每組3個(gè)復(fù)孔。具體實(shí)驗(yàn)方法：①取1ml 上述細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中，分別加入各組對(duì)應(yīng)藥物；②收集6 孔板各組細(xì)胞全部上清液和6 孔板貼壁細(xì)胞于5ml 離心管中，1 000g 離心5min，棄上清；③PBS 洗滌細(xì)胞1次，1 000g 離心5min，棄上清，用含1%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml；④取100μl 細(xì)胞懸液于1.5ml EP 管中，加入凋亡試劑100μl，輕柔充分混勻，室溫避光孵育30min；⑤300 目尼龍網(wǎng)濾過后，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 MTX和IFO 作用于U2-OS 細(xì)胞的IC50MTX和IFO 均按照1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml 設(shè)置濃度梯度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MTX 對(duì)U2-OS 細(xì)胞的IC50為（19.99±0.12）mg/ml，而IFO 對(duì)U2-OS 細(xì)胞的IC50為（32.07±0.69）mg/ml，見圖1。

圖1 MTX和IFO 抑制U2-OS 細(xì)胞增殖的IC50

2.2 MTX、IFO 及MTX 聯(lián)合IFO 對(duì)U2-OS 細(xì)胞增殖的影響研究顯示，MTX和IFO 均能抑制U2-OS細(xì)胞的增殖，且在16h、32h 及48h MTX的抑制效果優(yōu)于IFO，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而當(dāng)MTX和IFO 聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制效果更為明顯，與MTX組或IFO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2 及表1。

圖2 MTX、IFO 及MTX+IFO 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

表1 MTX、IFO 及MTX+IFO 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.3 MTX、IFO 及MTX 聯(lián)合IFO 對(duì)U2-OS 細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤U2-OS 細(xì)胞的凋亡率為4.25%，使用MTX 處理后細(xì)胞凋亡率上升為9.1%，而使用IFO 后細(xì)胞凋亡率為6.5%，MTX組和IFO組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均顯著上升，且MTX組的凋亡率高于IFO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而MTX和IFO 聯(lián)合作用后，細(xì)胞凋亡率上升為19.90%，較對(duì)照組、MTX組和IFO組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 MTX、IFO 及MTX+IFO 對(duì)U2-OS 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

骨肉瘤是臨床常見的骨科腫瘤，具有惡性程度高、致殘率和死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命安全，骨肉瘤對(duì)放化療敏感性較差，因此手術(shù)成為重要的治療手段，但5年生存率低，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高[8～10]。隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，化療藥物得到不斷的發(fā)展，新輔助化療也成為骨肉瘤手術(shù)治療的有效補(bǔ)充，可明顯提高患者5年生存率和生活 質(zhì)量。

MTX與葉酸結(jié)構(gòu)類似，是一種通過抑制二氫葉酸還原酶而發(fā)揮作用的抗葉酸類抗腫瘤藥物，其作用機(jī)理為通過抑制二氫葉酸還原酶進(jìn)而阻滯脫氧胸腺苷和嘌呤腺苷合成，干擾RNA和蛋白質(zhì)合成，從而阻止細(xì)胞增殖，對(duì)白血病以及多種實(shí)體腫瘤都有較好的臨床效果[11，12]。但臨床MTX 單藥使用需要較大劑量，在起到療效的同時(shí)給患者帶來肝功能損害、腎功能衰竭、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥，不僅影響療效，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致患者死亡[13]。因此，MTX 多與其他化療藥物聯(lián)合使用，在制劑間的修飾作用、用藥劑量、投藥順序等方面進(jìn)行調(diào)整而組成的化療方案在臨床取得較好效果，MTX也成為我國(guó)一線抗腫瘤化療藥物[14，15]。IFO 是磷酰胺類的衍生物，是第4個(gè)用于骨肉瘤化療的藥物，自1988年被FAD 批準(zhǔn)用于臨床后，其抗腫瘤作用就得到廣大醫(yī)護(hù)人員的關(guān)注。IFO 對(duì)骨肉瘤有較好的臨床療效，且不良反應(yīng)較輕，是一種治療骨肉瘤的關(guān)鍵化療藥物，臨床多用于對(duì)常規(guī)化療失敗的患者[16]。

目前，細(xì)胞增殖和凋亡在腫瘤形成過程中的重要作用已經(jīng)得到普遍認(rèn)可，細(xì)胞的惡性增殖和凋亡減少是腫瘤形成的重要原因。因此，化療藥物調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)。王亞鵬等[17]研究證實(shí)，褪黑素聯(lián)合順鉑、甲氨蝶呤在體外作用于骨肉瘤細(xì)胞，可有效增加細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，從而起到抗腫瘤作用。王建軍等[18]研究顯示，IFO 對(duì)人骨肉瘤Saos-2 細(xì)胞株有抑制作用。本研究旨在探討MTX和IFO 在體外對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖及凋亡的影響，以及二者聯(lián)合使用的效果。研究證實(shí)，體外實(shí)驗(yàn)中MTX和IFO 對(duì)U2-OS 細(xì)胞都具有抗增殖和促凋亡作用，且MTX 作用更為明顯，而當(dāng)MTX 聯(lián)合IFO 使用時(shí)，其抗增殖和促凋亡作用有較大幅度的提升，因而我們認(rèn)為MTX和IFO 對(duì)U2-OS的增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用具有一定的協(xié)同作用，猜測(cè)這可能與二者對(duì)細(xì)胞凋亡或增殖相關(guān)信號(hào)通路有交叉影響有關(guān)，但具體的分子機(jī)制尚未闡明，還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，MTX和IFO 均可抑制骨肉瘤細(xì)胞U2-OS 細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，而MTX的作用較IFO 更為明顯；MTX和IFO 具有一定的協(xié)同作用，兩者聯(lián)合使用對(duì)U2-OS 細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用更為顯著。