穆媛媛,熊 坤,劉 璐,樊 佳,張 丹,余 玥,鄧 沖,魏 聰,趙 容△

(1.遼河油田中心醫(yī)院消化科,遼寧盤錦 124010;2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室,重慶 400038; 3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川瀘州 646000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)，全球傷寒感染者約為1 700萬(wàn)[1]，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。針對(duì)傷寒的感染途徑，減毒疫苗具有免疫機(jī)制全面、成本低廉、使用方便、順應(yīng)性高等優(yōu)勢(shì)，是控制傷寒的有效手段。本研究將傷寒沙門菌3個(gè)參與鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)的基因iroN、fepA、cirA全部敲除，構(gòu)建三基因敲除株，并采用動(dòng)物模型對(duì)突變株的毒力進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)基 研究使用的菌株、質(zhì)粒和引物見(jiàn)表1。細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，如有需要，抗生素按以下濃度加入培養(yǎng)基：卡那霉素50 μg/mL；氨芐西林100 μg/mL。TMM基本培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7 g/L；磷酸二氫鉀1 g/L；硫酸鎂0.2 g/L；檸檬酸鈉0.5 g/L；半胱氨酸0.1 g/L；色氨酸0.1 g/L；硫酸銨0.1 g/L；葡萄糖5 g/L；pH 7.6。貧鐵培養(yǎng)基：以TMM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入180 μmol/L鐵螯合劑2,2/-dipyridyl制成，使用前加入氯化鐵至終濃度為5 μmol/L。

表1 菌株、質(zhì)粒和引物

1.2傷寒沙門菌三基因敲除株的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[2-3]，采用同源重組法將cirA、fepA、iroN3個(gè)基因從細(xì)菌染色體上一一敲除。以cirA基因的敲除為例說(shuō)明如下：以傷寒沙門菌基因組DNA為模板，采用crossover PCR擴(kuò)增傷寒沙門菌上下游序列并拼接在一起。即以P11和P12為引物擴(kuò)增cirA基因上游序列，以P13和P14為引物擴(kuò)增cirA基因下游序列，兩次PCR產(chǎn)物混合作為模板，以P11和P14擴(kuò)增，由于P12和P13引物序列中有一段33bp的互補(bǔ)序列(表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增可使上下游序列拼接在一起。PCR產(chǎn)物經(jīng)BglⅡ和ApaLⅠ雙酶切后插入自殺質(zhì)粒pYG4中，并測(cè)序驗(yàn)證。獲得的pYG4-ΔcirA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到傷寒沙門菌中，采用含有卡那霉素的LB平板篩選質(zhì)粒整合株(pYG4質(zhì)粒含有卡那霉素耐藥基因)。獲得的整合株于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取菌液涂布在含有5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。pYG4質(zhì)粒上有sacB基因，該基因編碼產(chǎn)物果聚糖合酶，可以分解蔗糖并合成高分子量的果聚糖，進(jìn)而造成細(xì)菌死亡。因此帶有該質(zhì)粒的細(xì)菌無(wú)法在含有5%蔗糖的LB平板上生長(zhǎng)，只有該質(zhì)粒通過(guò)同源重組從染色體上丟失后，細(xì)菌才能生長(zhǎng)。同源重組的結(jié)果有兩個(gè)，細(xì)菌恢復(fù)為野生型，或者成為敲除株，可以通過(guò)PCR進(jìn)行鑒定。故在培養(yǎng)16 h后，挑取菌落鑒定其卡那霉素敏感性，對(duì)卡那霉素敏感的菌落(染色體上的質(zhì)粒序列丟失)進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，鑒定準(zhǔn)確的敲除株ΔcirA保存于-80 ℃。接下來(lái)采用同樣的方法，以ΔcirA作為親本，將fepA基因敲除，進(jìn)而將iroN基因敲除，最終獲得的三基因敲除株保存-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3三基因敲除株生長(zhǎng)特征分析 將10 μL細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物(約含1×104CFU/mL)接種于10 mL 貧鐵培養(yǎng)基中(3個(gè)平行管)，于37 ℃震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取1 mL培養(yǎng)物測(cè)定600 nm吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4三基因敲除株半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定 采用小鼠胃黏蛋白增毒模型測(cè)定三基因敲除株和野生株的LD50。6～8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分5組，每組6只。取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物經(jīng)PBS洗滌后測(cè)定OD值，重懸于10%的豬胃黏蛋白液中配制系列濃度(野生5×105CFU/mL；三基因敲除株5×103～5×107CFU/mL)的菌懸液。取0.5 mL菌懸液進(jìn)行腹腔注射，動(dòng)物禁食喂水，觀察記錄72 h內(nèi)小鼠的死亡情況，采用概率單位加權(quán)回歸法(Bliss法)計(jì)算LD50。

表2 LD50測(cè)定結(jié)果

NA:未做

2 結(jié) 果

2.1構(gòu)建并獲得三基因敲除株 成功將傷寒沙門菌Ty2株的3個(gè)參與鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)的基因iroN、fepA、cirA一一敲除，如圖1所示，當(dāng)以一對(duì)被敲除基因外圍的引物分別擴(kuò)增野生株和敲除株的基因組DNA時(shí)，敲除株由于目的基因被敲除，故擴(kuò)增片段較野生株明顯小。PCR鑒定的結(jié)果顯示，3個(gè)基因均被有效敲除。

1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:引物P11和P14 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(三基因敲除株)；3:引物P11和P14 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(野生株)；4:引物P21和P24 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(三基因敲除株)；5:引物P21和P24 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(野生株)；6:引物P31和P34 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(三基因敲除株)；7:引物P31和P34 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(野生株)

圖1敲除株P(guān)CR鑒定電泳圖

圖2 細(xì)菌在貧鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線

2.2三基因敲除株在貧鐵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較野生株緩慢 采用2,2′-dipyridyl將培養(yǎng)基中的鐵離子螯合，然后在培養(yǎng)基中加入微量三價(jià)鐵造成一個(gè)貧鐵的環(huán)境。生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示，三基因敲除株在這種貧鐵環(huán)境中的生長(zhǎng)較野生株明顯緩慢(圖2)。

2.3三基因敲除株毒力顯著下降 為了進(jìn)一步測(cè)定和評(píng)價(jià)三基因敲除株及野生株的毒力，本研究采用小鼠急性感染模型測(cè)定了傷寒沙門菌野生株和敲除株的LD50，分別為3.64×101CFU和3.56×106CFU(表2)。

3 討 論

傷寒的自然感染途徑是糞-口途徑，其保護(hù)性免疫機(jī)制包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫[4]，其中黏膜免疫可以有效阻止病原體在腸黏膜表面的定居和繁殖，對(duì)于阻斷再次感染發(fā)揮了重要作用。因此，針對(duì)傷寒的疫苗設(shè)計(jì)，口服減毒疫苗方式具有很多優(yōu)勢(shì)：(1)減毒疫苗通過(guò)自然感染途徑接種，除了誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫外，還可以有效誘導(dǎo)黏膜免疫，免疫機(jī)制全面，免疫效果好；(2)其次在接種方式上，口服方式比較方便、簡(jiǎn)單，不需要注射器和專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員。為非侵入性接種，接種者順應(yīng)性高，尤其適合兒童。(3)避免疫苗與全身循環(huán)的直接接觸，減輕不良反應(yīng)。(4)沙門菌減毒疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，疫苗成本相對(duì)較低。沙門菌減毒疫苗的研制和應(yīng)用已有很長(zhǎng)的歷史，例如傷寒沙門菌Ty21a和眾多鼠傷寒沙門菌減毒株等，其良好的安全性得到大量實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的證實(shí)[5-6]。另外，沙門菌是最早應(yīng)用于疫苗載體的細(xì)菌之一，也是目前研究最深入的活菌疫苗載體，已被廣泛用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、腫瘤等疫苗的研制并展示了良好的應(yīng)用前景[5-6]。

本研究通過(guò)敲除涉及鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)的3個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)細(xì)菌的減毒，理論依據(jù)是鐵攝取功能對(duì)于細(xì)菌生存至關(guān)重要。雖然自然界中有非常豐富的鐵元素，然而對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，卻是個(gè)“貧鐵”的環(huán)境。這是因?yàn)殍F在有氧條件下主要以三價(jià)鐵形式存在，在中性及偏堿性環(huán)境中，三價(jià)鐵由于形成Fe(OH)3以及羥基氧化鐵而幾乎不溶，細(xì)菌很難直接從環(huán)境中獲得游離鐵的供應(yīng)[7-9]。為了生存，多數(shù)細(xì)菌會(huì)通過(guò)合成并分泌鐵載體(siderophores，一種與鐵離子具有高親和力的螯合劑)到環(huán)境中去爭(zhēng)奪鐵離子[7]；然而，結(jié)合了鐵的鐵載體并不能直接通過(guò)細(xì)菌外膜回到菌體內(nèi)，必須借助外膜上TonB依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TonB-dependent Transporters,TBDTs)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。與之相似，在人和動(dòng)物體內(nèi)，鐵元素主要以結(jié)合方式存在于轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等鐵蛋白中而無(wú)法被自由利用，但細(xì)菌同樣可以通過(guò)鐵載體從這些含鐵蛋白中爭(zhēng)奪鐵元素，再由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到菌體內(nèi)利用。既往研究顯示，這些涉及鐵攝取的TBDTs 對(duì)病原菌在體內(nèi)的生存和致病有重要作用[7-9]。

實(shí)驗(yàn)研究和生物信息學(xué)分析顯示傷寒沙門菌一共有6個(gè)TBDTs(FoxA、YncD、BtuB、IroN、FepA和CirA)，其中5個(gè)涉及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)。FoxA轉(zhuǎn)運(yùn)高鐵氧胺鐵載體；YncD涉及轉(zhuǎn)鐵，但鐵載體類型未知。IroN、FepA和CirA主要涉及兒茶酚胺類鐵載體，IroN能轉(zhuǎn)運(yùn)2,3-二羥苯甲?；z氨酸、腸菌素、沙門螯合素；FepA能夠轉(zhuǎn)運(yùn)2,3-二羥苯甲?；z氨酸和腸菌素；而CirA只能轉(zhuǎn)運(yùn)2,3-二羥苯甲?；z氨酸，三者在功能上具有一定互補(bǔ)性[10-12]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)3個(gè)基因被敲除后導(dǎo)致細(xì)菌毒力顯著下降，表明以這3個(gè)基因作為減毒的敲除靶基因是適合的。當(dāng)然，后續(xù)還需要對(duì)減毒株的免疫保護(hù)效能及其免疫機(jī)制進(jìn)行全面而系統(tǒng)的研究，才有可能將該減毒株納入傷寒疫苗株的候選。