葉云飛,蒙文霞,陳 瀅,周一萍,李文怡,陳柏秀

(廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院產(chǎn)科 545006)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠中晚期最常見的特發(fā)性肝臟功能紊亂性疾病。臨床上以皮膚瘙癢及血清總膽汁酸水平升高為特點(diǎn),發(fā)病率為0.2%～2.0%[1-2]。ICP是嚴(yán)重威脅母嬰健康的妊娠期并發(fā)癥，可導(dǎo)致早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息、羊水胎糞污染等，使圍生兒病死率明顯增高[3]。ICP的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其病因?qū)W仍不清楚。多數(shù)研究認(rèn)為是遺傳變異、內(nèi)分泌、免疫功能失常及環(huán)境因素等多因素共同作用的結(jié)果[4]。曹麗瓊等[5]研究報(bào)道細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子3(SOCS3)參與了ICP的發(fā)病。而對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)在ICP患者胎盤中的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過檢測(cè)重度ICP孕婦和健康孕婦胎盤組織中STAT3、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)水平，初步探討STAT3在ICP發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2017年12月在柳州市人民醫(yī)院產(chǎn)科住院治療、資料完整的剖宮產(chǎn)分娩的重度ICP孕婦25例為試驗(yàn)組。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)2015年公布的ICP診療指南[6]，重度ICP的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清總膽汁酸水平大于或等于40 μmol/L；(2)瘙癢嚴(yán)重伴或不伴有黃疸、皮膚抓痕；(3)復(fù)發(fā)性ICP。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除肝炎病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒感染。試驗(yàn)組年齡29.3歲(27～37歲)，孕周37+3周(36～40周)。選擇同期健康順產(chǎn)孕婦30例為對(duì)照組，年齡28.5歲(24～36歲)，孕周39+3周(37～41周)。兩組孕婦年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，孕周比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組孕婦既往均無高血壓、心臟病、腎臟疾病、糖尿病及甲狀腺功能異常等基礎(chǔ)病史，無輸血及免疫治療史。本研究經(jīng)柳州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)討論并批準(zhǔn)，并經(jīng)所有孕婦知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集及處理 胎盤娩出后10 min內(nèi)，于臍根正對(duì)面，避開淤血、壞死及鈣化區(qū)迅速剪取絨毛組織(無蛻膜組織及羊膜)2塊約1 cm×1 cm×1 cm，其中1塊用生理鹽水沖洗并擦干，放入10%甲醛中固定24～48 h后用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另1塊迅速置于10%甲醛中，用于蛋白印跡法檢測(cè)。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤組織中STAT3、IL-6和TNF-α的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP法)測(cè)定胎盤組織中STAT3、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。STAT3、IL-6和TNF-α抗體試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。操作按說明書上步驟進(jìn)行。結(jié)果判定：染色結(jié)果分別由2位病理學(xué)專業(yè)醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估。STAT3、IL-6、TNF-α陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：0%～<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<75%為2分，≥75%為3分。按細(xì)胞質(zhì)或胞核著色程度評(píng)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將兩項(xiàng)得分相乘，<2分判為陰性(-)，≥2分為陽(yáng)性(+)。

1.2.3平均光密度值測(cè)定 采用美國(guó)Media cybernetics 公司生產(chǎn)的Imagepro-plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)免疫組織化學(xué)照片進(jìn)行光密度分析。每張切片選取3張400倍照片做光密度分析，

1.2.4蛋白印跡法檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)水平 組織裂解、離心后得到蛋白樣本，測(cè)定總蛋白濃度，上樣電泳。電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，加入小牛血清蛋白封閉液封閉。加入STAT3一抗(兔抗人單克隆抗體 1∶10 000稀釋)，β-actin抗體(1∶800稀釋)，4 ℃過夜，分別加入二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育。ECL顯影、曝光。掃描曝光片后，應(yīng)用Quantity圖像分析系統(tǒng)分析目的條帶，記錄條帶灰度值。蛋白印跡條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值作為STAT3蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1STAT3、IL-6、TNF-α在胎盤組織中的定位及表達(dá) STAT3在兩組孕婦胎盤組織中均有表達(dá)，STAT3定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核；呈現(xiàn)淺黃色、棕黃色或褐色染色顆粒，STAT3在試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在對(duì)照組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)。IL-6定位在滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞質(zhì)； TNF-α定位在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞胞核。STAT3、IL-6和TNF-α在試驗(yàn)組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中STAT3、IL-6、TNF-α平均光密度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1～3。

A：對(duì)照組；B：試驗(yàn)組

圖1兩組STAT3的表達(dá)(SP×400)

A：對(duì)照組；B：試驗(yàn)組

圖2兩組IL-6的表達(dá)(SP×400)

A：對(duì)照組；B：試驗(yàn)組

圖3兩組TNF-α的表達(dá)(SP×400)

表1 兩組中STAT3、IL-6、TNF-α細(xì)胞陽(yáng)性率及平均光密度值

2.2孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中STAT3陽(yáng)性細(xì)胞率及平均光密度值 試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中STAT3陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中STAT3平均光密度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中IL-6、TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中IL-6、TNF-α平均光密度值明顯高于對(duì)照組，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3STAT3在胎盤組織中的表達(dá)定量 免疫印跡檢測(cè)顯示，對(duì)照組、試驗(yàn)組孕婦胎盤組織中均可檢測(cè)到STAT3蛋白的表達(dá)，試驗(yàn)組STAT3表達(dá)水平(1.05±0.10)明顯高于對(duì)照組(0.38±0.07)。兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組胎盤組織STAT3蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.4試驗(yàn)組孕婦胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中STAT3與IL-6、TNF-α的相關(guān)性分析 試驗(yàn)組中STAT3表達(dá)強(qiáng)度與IL-6、TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(r=0.687，r=0.891，P<0.05)，見表2。

表2 試驗(yàn)組STAT3與IL-6、TNF-α的相關(guān)性

3 討 論

3.1STAT3在ICP母胎界面的變化 JAK/STAT信號(hào)通路目前已成為研究細(xì)胞膜到細(xì)胞核信號(hào)傳遞中的經(jīng)典信號(hào)途徑。而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)通路是JAK/STAT信號(hào)通路研究的熱點(diǎn)之一。STAT3能被許多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和其他刺激因素所激活發(fā)揮作用，激活的STAT3(P-STAT3)可以調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子表達(dá)，并可介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等重要生理活性。FITZGERALD等[7-8]研究顯示STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活性與絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡、遷移和侵襲相關(guān)。曹麗瓊等[5]研究報(bào)道SOCS3參與了ICP的發(fā)病。本研究對(duì)ICP孕婦和健康孕婦胎盤組織中STAT3的表達(dá)進(jìn)行分析，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：STAT3定位在胎盤組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核；ICP時(shí)胎盤中STAT3表達(dá)水平顯著高于健康孕婦。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示:兩組孕婦胎盤組織中均可檢測(cè)到STAT3蛋白的表達(dá)，試驗(yàn)組(1.05±0.10)明顯高于對(duì)照組(0.38±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故無論是定性實(shí)驗(yàn)還是定量實(shí)驗(yàn)均提示：ICP時(shí)胎盤中STAT3表達(dá)水平顯著高于健康孕婦。ICP患者的母胎界面STAT3表達(dá)增高，提示STAT3可能參與了ICP的發(fā)病。

3.2IL-6、TNF-α在胎盤中的定位及表達(dá) 近年研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)一些細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)對(duì)ICP具有重要意義。IL-6是由淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，有廣泛的生物學(xué)作用，可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化并產(chǎn)生免疫球蛋白，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)等。IL-6在妊娠、分娩及胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)ICP患者血清中IL-6的表達(dá)明顯高于正常妊娠，且隨著病情的加重該指標(biāo)值不斷升高，IL-6還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌黏附分子進(jìn)而發(fā)揮損傷作用，據(jù)此通過監(jiān)測(cè)血清中IL-6的水平可以了解ICP患者病情的嚴(yán)重程度。研究[9-10]顯示，人類子宮內(nèi)膜和胎盤組織中存在大量的巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞在接受同種異型胎兒抗原刺激后可分泌TNF-α，適量的TNF-α可調(diào)節(jié)胎兒與胎盤組織的生長(zhǎng)，促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的合成，刺激孕酮和絨毛膜促性腺激素(HCG)的分泌，防止母體對(duì)胎兒產(chǎn)生排斥反應(yīng)。BULL等[11]研究發(fā)現(xiàn)ICP患者胎盤中細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)明顯增加，誘發(fā)ICP發(fā)病。TNF-α誘導(dǎo)ICP胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡，使黏附分子的表達(dá)上調(diào)，ICP患者發(fā)生體內(nèi)免疫損傷和免疫排斥，TNF-α可以促進(jìn)雌激素在胎盤的合成和分泌，加重ICP。TNF-α具有雙重生物學(xué)效應(yīng)，生理狀態(tài)下參與機(jī)體免疫防護(hù)，病理狀態(tài)下大量TNF-α造成機(jī)體免疫損傷。從免疫學(xué)觀點(diǎn)來看，TNF-α屬于Th1型細(xì)胞因子[11-12]。已有研究[13-14]表明免疫功能失衡可能會(huì)破壞孕婦免疫微環(huán)境,導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)各種病理性妊娠反應(yīng)。ICP孕婦的Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡發(fā)生變化，Th1的表達(dá)更明顯。本研究結(jié)果顯示，ICP患者的IL-6、TNF-α表達(dá)水平比健康孕婦異常增高。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[9-10]的研究結(jié)果相符合。本研究提示，IL-6、TNF-α表達(dá)的異常增高與ICP患者病理性妊娠反應(yīng)有著極為密切的關(guān)系，并且可能導(dǎo)致胎兒不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

3.3STAT3與IL-6、TNF-α相關(guān)性 王斯南等[15]通過免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)膽酸對(duì)IL-6/STAT3通路的激活情況。結(jié)果顯示：膽酸可通過誘導(dǎo)腸道低度炎性反應(yīng)激活I(lǐng)L-6/STAT3通路。NGUYEN等[16]研究發(fā)現(xiàn)：STAT3是IL-6的核心效應(yīng)分子。細(xì)胞因子TNF-α是體內(nèi)重要的早期促炎因子，TNF-α的mRNA上有STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，活化后的STAT3可以入核與TNF-α的mRNA上S1Ⅺ3的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，增強(qiáng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致TNF-α的大量釋放；而細(xì)胞因子受體與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合后又可進(jìn)一步促進(jìn)JAK/STAT通路的活化，從而對(duì)JAK/STAT通路進(jìn)行“正反饋”調(diào)節(jié)，使炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)不斷放大。

LUO等[17]在構(gòu)建妊娠高血壓大鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，STAT3可以改善妊娠高血壓大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，STAT3與TNF-α、IL-6的表達(dá)具有正相關(guān)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：無論是定量還是定性實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)STAT3的表達(dá)與胎盤組織中IL-6、TNF-α水平呈正相關(guān)。說明IL-6對(duì)TNF-α的調(diào)控，可能是通過STAT3信號(hào)通路完成。IL-6高表達(dá)激活了STAT3表達(dá)，活化后的STAT3進(jìn)入細(xì)胞核與TNF-α結(jié)合，導(dǎo)致TNF-α的大量釋放，從而使TNF-α表達(dá)異常增高，打破了Th1/Th2平衡，Th1表達(dá)明顯，從而導(dǎo)致ICP的發(fā)病最終導(dǎo)致ICP發(fā)病。是否可以通過阻斷該通路達(dá)到一定的治療作用，減少患者及新生兒的不良結(jié)局的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)準(zhǔn)確及詳細(xì)分析ICP患者提供一定的參考，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，通過對(duì)STAT3的檢測(cè)并結(jié)合TNF-α、IL-6的表達(dá)情況能從信號(hào)通路這一方面更深入了解ICP疾病的發(fā)病情況，開拓了ICP發(fā)病機(jī)制的新思路。而孕期通過檢測(cè)IL-6、STAT3和TNF-α水平可了解胎兒宮內(nèi)環(huán)境，對(duì)臨床終止妊娠時(shí)機(jī)的選擇提供了理論依據(jù)。目前，對(duì)ICP病理生理過程認(rèn)識(shí)較局限，STAT3信號(hào)通路的研究為ICP的發(fā)病提供了新的思路，而對(duì)其藥物治療提供了重要的研究方向，可針對(duì)該通路選擇對(duì)胎兒影響小，更有效的藥物進(jìn)行治療，或能成為治療ICP的一條新的路徑。