邵 玲，周夢(mèng)橋，熊濤，鄧長(zhǎng)金

(湖北省荊門(mén)市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 448000)

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病和死亡的主要原因。在急性心肌梗死后，心肌細(xì)胞大量死亡，觸發(fā)一系列的分子和細(xì)胞重構(gòu)反應(yīng)包括炎性反應(yīng)、心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)、纖維化增生和膠原疤痕的形成[1]。在早期上述重構(gòu)過(guò)程能夠保持心臟的完整性和維持心臟功能，然而持續(xù)的梗死后重構(gòu)將最終導(dǎo)致左室擴(kuò)張、心功能不全，最終發(fā)展成為心力衰竭[2]。目前臨床上的藥物并不能抑制甚至逆轉(zhuǎn)重構(gòu)的心臟[3]，因此心力衰竭患者的發(fā)病率逐年升高。為此，尋找新的藥物靶點(diǎn)迫在眉睫。

楊梅素是藥物化學(xué)的重要天然產(chǎn)品之一，已有研究報(bào)道楊梅素具有多種功效：抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化應(yīng)激和降糖活性[4-6]。在心臟中的研究表明，楊梅素可以減輕大鼠心臟急性缺血再灌注損傷，可減少鹽敏感性大鼠心臟損傷[7]。此外，楊梅素還可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷[8]。上述研究均提示楊梅素可能對(duì)心肌損傷后重構(gòu)具有抑制作用。本研究采用心肌梗死模型，旨在探討楊梅素對(duì)心肌梗死后心臟重構(gòu)的影響和具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠(SPF級(jí))，飼養(yǎng)于隔離屏障設(shè)施的環(huán)境中；購(gòu)買(mǎi)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)-2015-0132；動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0131，體質(zhì)量 23.5～27.5 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組(n=10)；模型組(n=20)；低濃度楊梅素組(n=20)：100 mg·kg-1·d-1楊梅素灌胃處理，術(shù)后3 d開(kāi)始，持續(xù)到術(shù)后4周；高濃度楊梅素組(n=20)：300 mg·kg-1·d-1楊梅素灌胃處理，術(shù)后3 d開(kāi)始，持續(xù)到術(shù)后4周。

1.2試劑 楊梅素(純度大于 98%，上海融禾生物有限公司)；P-PI3K抗體(4228S)，T-PI3K抗體(4257)，P-AKT抗體(4060)，T-AKT抗體(4691)，P-mTOR抗體(2971)，T-mTOR抗體(2983)，GAPDH抗體(2118)均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.3心肌梗死模型制備 采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立心肌梗死模型。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，在胸骨左緣縱行切開(kāi)皮膚暴露心臟，在左心耳下緣2～3 mm處用8-0的聚丙烯縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，以心電圖ST段抬高確定心肌缺血形成，對(duì)照組以相同的方法掛線，但是不結(jié)扎。迅速將心臟送回胸腔，縫合胸壁。術(shù)后3 d開(kāi)始喂藥處理。

1.4超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 采用小動(dòng)物超聲系統(tǒng)檢測(cè)小鼠心功能。收集的數(shù)據(jù)包括：左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，左室短軸縮短率(LVFS)。

1.5心肌梗死面積的計(jì)算 術(shù)后4周，取小鼠心臟，采用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，用Iimage J1.44軟件計(jì)算心肌梗死面積。

1.6HE、天狼星紅(PSR)和免疫組化染色 采用蘇木素和伊紅進(jìn)行HE染色；采用PSR進(jìn)行膠原染色；采用免疫組化染色CD45和CD68，DAB顯色法進(jìn)行炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)記。

1.7RT-qPCR檢測(cè) 采用TRIzol(Invitrogen公司)提取心臟的總RNA；采用羅氏公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用羅氏Light Cycler 480 SYBR Green熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)果與內(nèi)參基因GPADH進(jìn)行對(duì)比。

1.8Western blot檢測(cè) 采用裂解法提取小鼠心臟總蛋白，采用BCA試劑進(jìn)行蛋白定量。采用10%的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳。所用一抗包括：磷酸化和總的PI3K、AKT、mTOR和內(nèi)參蛋白GAPDH(均購(gòu)買(mǎi)于CST公司)。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，每組磷酸化蛋白的表達(dá)水平用其相應(yīng)的總蛋白表達(dá)校準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1楊梅素提高心肌梗死后小鼠存活率，改善心功能，減小心肌梗死面積 低濃度和高濃度楊梅素處理后的小鼠存活率明顯高于模型組(P<0.05)。且兩種濃度的楊梅素處理組小鼠心肌梗死面積明顯縮小(P<0.05)，其心臟重量顯著低于模型組(P<0.05)。此外，超聲心動(dòng)圖結(jié)果提示低濃度和高濃度楊梅素能明顯改善心肌梗死后4周小鼠的心功能：LVESd和LVEDd明顯小于模型組，而LVEF和LVFS明顯高于模型組(P<0.05)。兩種濃度的楊梅素處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2楊梅素降低心肌肥厚程度 心肌梗死4周后，模型組小鼠心肌肥厚程度明顯增高；心肌肥厚相關(guān)基因A型利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)和肌球蛋白重鏈β(β-MHC)的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著抑制心肌肥厚程度，降低心肌肥厚相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。高濃度楊梅素處理組效果優(yōu)于低濃度處理組(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表2。

表1 各組小鼠生存率、梗死面積以及心功能的比較

*：P<0.05，與對(duì)照相組比較；#：P<0.05 ，與模型組比較

圖1 各組HE染色心肌肥厚程度

圖2 各組PSR染色心肌纖維化程度

項(xiàng)目對(duì)照組模型組低濃度組高濃度組ANP0.32±0.013.24±0.03?1.55±0.01?#1.07±0.02?#BNP0.27±0.022.98±0.01?1.43±0.03?#1.19±0.02?#β-MHC0.14±0.023.22±0.01 ?1.09±0.02?#0.88±0.02?#Collgen Ⅰ(×10-2)1.09±0.1213.43±1.11?8.12±0.13?#6.99±0.18?#Collgen Ⅲ(×10-2)1.14±0.7614.34±1.21?8.55±1.99?#6.67±1.09?#CTGF(×10-3)2.09±1.1115.43±2.12?7.43±1.23?#5.21±1.87?#TGF-β(×10-4)1.98±0.1212.28±2.24?8.34±1.34?#6.28±1.11?#

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

表3 各組小鼠心臟心肌炎癥和氧化應(yīng)激水平

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

2.3楊梅素降低心肌纖維化水平 心肌梗死4周后，模型組小鼠心肌纖維化及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加：Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)，Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)。低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著抑制心肌纖維化水平；減少纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。高濃度楊梅素處理組效果優(yōu)于低濃度處理組(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表2。

2.4楊梅素降低心肌炎性反應(yīng) 心肌梗死4周后，模型組小鼠CD45和CD68陽(yáng)性的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，炎癥相關(guān)基因[白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)]的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著減少CD45和CD68陽(yáng)性的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；減少I(mǎi)L-1、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。不同濃度楊梅素處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

2.5楊梅素降低心肌氧化應(yīng)激水平 心肌梗死4周后，模型組小鼠還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞基gp91和P67的轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯降低，小鼠心臟脂質(zhì)過(guò)氧化中間代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)明顯增多；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著減少gp91和P67的轉(zhuǎn)錄水平；增加SOD活性，減少M(fèi)DA產(chǎn)生(P<0.05)。不同濃度楊梅素處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

圖3各組CD45和CD68陽(yáng)性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量

表4 各組心臟AKT信號(hào)蛋白的相對(duì)表達(dá)

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

圖4 各組AKT信號(hào)通路的改變

2.3楊梅素激活A(yù)KT信號(hào)通路 模型組小鼠心臟AKT活化程度明顯降低(P<0.05)，且其上游PI3K和下游蛋白mTOR磷酸化水平降低(P<0.05)。低濃度和高濃度楊梅素處理后AKT信號(hào)通路蛋白PI3K，AKT和mTOR的磷酸化水平明顯提高(P<0.05)。不同濃度處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4、圖4。

3 討 論

以往的研究表明楊梅素通過(guò)抑制P38信號(hào)通路減輕大鼠心臟急性缺血再灌注損傷[4]。楊梅素可減少鹽敏感性大鼠心臟損傷[7]。楊梅素還可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷[8]。上述研究均側(cè)重于楊梅素對(duì)抗心肌的急性損傷作用。而本研究采用心肌梗死模型，楊梅素給予處理至術(shù)后4周，探討楊梅素對(duì)心肌梗死后心臟重構(gòu)的影響，結(jié)果提示楊梅素能夠減少小鼠心肌梗死后4周的死亡率，減少心肌梗死面積，改善梗死4周后的心功能。

心肌梗死后的心臟重構(gòu)是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程。在心肌梗死早期(梗死后1～2周)，壞死和凋亡的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)一系列炎性反應(yīng)。適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)促進(jìn)死亡的心肌細(xì)胞清除[9]；炎癥細(xì)胞分泌的促炎癥因子可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的激活和分泌，促進(jìn)心肌纖維化[10]。在疾病早期，上述重構(gòu)有助于維持心臟的完整性和功能。隨著重構(gòu)的持續(xù)(梗死后3～4周)，梗死周邊區(qū)域殘余的心肌細(xì)胞為滿足心臟的做功要求，發(fā)生肥厚性增生，在此過(guò)程中胚胎基因過(guò)度激活(ANP、BNP、β-MHC)，成為心臟重構(gòu)的標(biāo)志物[11]；此外，纖維化過(guò)度增生導(dǎo)致左室僵硬度增加，心室順應(yīng)性降低，影響心臟的舒張功能[11]。本研究發(fā)現(xiàn)楊梅素能夠顯著減少心臟重量和心臟重構(gòu)標(biāo)志物ANP、BNP、β-MHC的表達(dá)；減少纖維化標(biāo)志物Ⅰ型collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和促纖維化因子CTGF、TGF-β的轉(zhuǎn)錄。提示楊梅素能夠阻止心肌梗死后心臟重構(gòu)的發(fā)展。

在心肌梗死后期，過(guò)度的炎性反應(yīng)造成促纖維化因子大量分泌，刺激成纖維細(xì)胞增殖分化和分泌，促進(jìn)心肌纖維化；此外，過(guò)多的炎性反應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷凋亡增多，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，影響心臟收縮功能[12]。氧化應(yīng)激在心肌梗死后心臟重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下，ROS作為第二信使發(fā)揮重要的信號(hào)傳遞功能；然而在病理?xiàng)l件下ROS產(chǎn)生和清除失衡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。一方面氧化應(yīng)激引起細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA損傷；另一方面氧化應(yīng)激激活多種炎癥和心臟重構(gòu)相關(guān)通路，刺激心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素能夠減少心肌梗死后CD45和CD68炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少促炎癥因子的合成；減少氧化酶NADPH的表達(dá)，而增加抗氧化酶SOD的活性。提示楊梅素能夠阻止心肌梗死后心肌炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

PI3K/AKT是胰島素受體被激活后的重要的信號(hào)通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、葡萄糖攝取、細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成方面發(fā)揮核心作用[14]。在心肌細(xì)胞中，AKT信號(hào)通路還參與細(xì)胞存活、血管生成、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激。在受到胰島素信號(hào)刺激后，PI3K磷酸化激活，促進(jìn)下游的AKT蛋白磷酸化激活，后者可刺激多種下游分子[15]。其中mTOR通過(guò)mTORC1復(fù)合體激活后促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、生長(zhǎng)和存活[16]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死4周AKT信號(hào)通路蛋白明顯失活，而低濃度和高濃度楊梅素處理能夠重新激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，降低小鼠死亡，抑制心臟重構(gòu)的發(fā)展。

綜上所述，楊梅素能夠通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，阻斷心肌梗死后的心臟重構(gòu)。楊梅素可能成為治療心臟重構(gòu)的新思路。