于莉娜,田 燕,翁雅倩,吳晶晶,布威阿麗耶,楊敏慧

(南方醫(yī)科大學(xué)：1.南方醫(yī)院病理科；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣州 510515)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期的、多因素、多步驟的綜合調(diào)控過程，細(xì)胞增殖活性改變是其重要環(huán)節(jié)，通過檢測(cè)細(xì)胞增殖活性來評(píng)價(jià)腫瘤惡性度和預(yù)后已成為一種趨勢(shì)[1]。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(T lymphoma invasion and metastasis,Tiam1)是目前最受重視的一種鳥嘌呤核酸轉(zhuǎn)換因子之一，參與細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[2]，是一種重要的促癌基因[3]。本研究以Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠及裸鼠為實(shí)驗(yàn)載體，探討活體狀態(tài)下Tiam1在增殖中的功能及作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠為南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系自建并保種，ICR小鼠及SPF級(jí)4～6周齡裸鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)用小鼠均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)屏障動(dòng)物房，保持環(huán)境溫度22 ℃，濕度55%，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠飼料和無菌飲水。穩(wěn)定過表達(dá)Tiam1的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29-Tiam1及陰性對(duì)照細(xì)胞株 HT29-Vector均為南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系自建并凍存。

1.2主要試劑 兔抗鼠Ki-67抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化EnVision兩步法試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自廣州一科科技有限公司。

1.3Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠多臟器組織病理形態(tài)學(xué)觀察 以頸椎脫臼法隨機(jī)處死6只Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠及6只野生型ICR小鼠，解剖取材全身各臟器，組織塊經(jīng)10%中性甲醛固定過夜后，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，蘇木素-伊紅染色，中性樹脂封片。對(duì)比觀察體內(nèi)持續(xù)過表達(dá)Tiam1對(duì)小鼠各臟器組織細(xì)胞增殖能力的影響。

1.4免疫組化檢測(cè)小鼠Ki-67蛋白表達(dá) 免疫組化兩步法檢測(cè)小鼠多器官組織中Ki-67蛋白表達(dá)情況。石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)，3% H2O2孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，Ki-67抗體以1∶500于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌后滴加二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，水洗；蘇木素襯染，脫水，封片，鏡檢。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Ki-67陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核，呈黃褐色，背景清晰，每張玻片于高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野，隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，其中無陽(yáng)性著色視為陰性(-)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于25%為+，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～<50%為++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～<75%為+++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于或等于75%為++++。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)及皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29-Tiam1及HT29-Vector均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。取裸鼠6只，分別將兩種細(xì)胞懸液取5×106個(gè)細(xì)胞注射于裸鼠右背側(cè)皮下，5 d后每日測(cè)量并記錄腫瘤體積，計(jì)算體積公式[4]為V=L×W×H/2 (V表示體積;L表示長(zhǎng);W表示寬;H表示高)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠多臟器病理形態(tài)學(xué)觀察 Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型ICR小鼠經(jīng)解剖后，多組織器官HE切片觀察發(fā)現(xiàn)，Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)直腸、胃、肺、腎臟以及睪丸均較對(duì)照組表現(xiàn)出更顯著的增殖能力(圖1)。與野生型小鼠相比，Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)直腸及胃黏膜均顯著增厚，固有層腺體層次增多，排列擁擠，上皮細(xì)胞核大、深染，部分區(qū)域細(xì)胞核上移；肺臟中支氣管上皮增生，被覆的纖毛柱狀上皮由假?gòu)?fù)層轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層，細(xì)胞密集深染，局部纖毛消失，部分區(qū)域肺泡間隔增寬；腎臟中近曲小管數(shù)量增多，排列擁擠，細(xì)胞核增大，染色質(zhì)增粗；睪丸的曲精管密集排列，間質(zhì)受壓，各級(jí)生精細(xì)胞顯著增生，管腔充盈。

圖1通過組織形態(tài)學(xué)及Ki-67免疫組化檢測(cè)Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠多臟器細(xì)胞增殖情況

表1 HT29-Tiam1和HT29-Vector細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤增殖能力的比較

*:主效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值；#:交互效應(yīng)的F統(tǒng)計(jì)量和P值

1：皮下注射HT29-Tiam1組裸鼠；2：皮下注射HT29-Vector組裸鼠

圖2體式熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀測(cè)HT29-Tiam1+/+和HT29-Vector組裸鼠皮下成瘤情況

2.2小鼠多臟器Ki-67蛋白表達(dá)檢測(cè) Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠多組織器官中Ki-67均有不同程度的表達(dá)，但是在結(jié)直腸、胃、肺、腎臟以及睪丸中，Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的Ki-67蛋白表達(dá)水平明顯高于野生型小鼠對(duì)應(yīng)組織(圖1)。 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)直腸及胃黏膜Ki-67蛋白表達(dá)散布于上皮細(xì)胞全層，而野生型小鼠主要位于黏膜基底部；轉(zhuǎn)基因小鼠的肺支氣管及腎近曲小管上皮細(xì)胞Ki-67均呈廣泛表達(dá)，而野生型小鼠的表達(dá)量及表達(dá)范圍均顯著減少；轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸的初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞均表達(dá)Ki-67，而野生型小鼠僅基底部的初級(jí)精母細(xì)胞呈Ki-67表達(dá)陽(yáng)性。

2.3Tiam1過表達(dá)對(duì)裸鼠皮下成瘤能力的影響 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HT29-Tiam1細(xì)胞株在裸鼠皮下增殖能力顯著強(qiáng)于HT29-Vector細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1、圖2。

3 討 論

細(xì)胞增殖是生命的重要特征，是所有細(xì)胞延續(xù)生命的主要形式，是在轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾等多層面、多種蛋白質(zhì)參與的精細(xì)調(diào)控過程。腫瘤細(xì)胞異常增殖的根本原因在于基因水平上失去了對(duì)增殖的正常調(diào)控，因此對(duì)細(xì)胞增殖的研究一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。已有研究表明，Tiam1是多種腫瘤的促癌基因[4]，與淋巴瘤、結(jié)直腸癌[5]、肺癌[6]、乳腺癌[7]等腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。但是體外基因功能研究往往不能完全模擬基因在體作用形式和機(jī)制，Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的引入能夠在活體內(nèi)接近“真實(shí)”地再現(xiàn)Tiam1過表達(dá)所導(dǎo)致的直接后果，把復(fù)雜系統(tǒng)簡(jiǎn)化，為Tiam1的體內(nèi)功能研究提供了有力的工具。

本研究結(jié)果顯示，Tima1基因持續(xù)過表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠體內(nèi)多組織器官的細(xì)胞增殖能力。Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)直腸及胃黏膜上皮、支氣管上皮及肺泡上皮、腎小管上皮以及睪丸各級(jí)生精細(xì)胞均呈現(xiàn)顯著的增殖過度，表現(xiàn)為細(xì)胞排列密集、細(xì)胞核大、深染等。 Ki-67免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的結(jié)果，Tiam1+/+轉(zhuǎn)基因小鼠的Ki-67陽(yáng)性率均顯著高于野生型小鼠。由于細(xì)胞的持續(xù)增殖狀態(tài)是腫瘤早期發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此提示Tiam1在腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)過程中可能發(fā)揮較為重要的作用。目前在人結(jié)直腸癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]、腎透明細(xì)胞癌[12]及睪丸精原細(xì)胞瘤中均有Tiam1促進(jìn)腫瘤發(fā)生的相關(guān)報(bào)道，與本研究結(jié)果較一致。

為了進(jìn)一步探討Tima1與腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性，本研究選取了本室自建并保存的結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29-Tiam1和HT29-Vector進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Tiam1基因同樣能夠顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖。因此筆者推測(cè)，Tiam1作為增殖調(diào)控基因，Tiam1在正常細(xì)胞→過度增殖→惡性轉(zhuǎn)化→腫瘤進(jìn)展這一演進(jìn)過程中擔(dān)任重要的角色。目前已有研究表明，Tiam1可能通過以下機(jī)制發(fā)揮其促癌作用：(1)特異性的激活β-cat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[13]；(2)通過參與Tiam1-Rac信號(hào)傳導(dǎo)通路增強(qiáng)抗凋亡蛋白的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活[14]；(3)抑制轉(zhuǎn)錄因子c-myc的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[15]。

綜上所述，本研究以Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠及裸鼠為載體在活體內(nèi)整體水平探討了Tiam1在細(xì)胞增殖調(diào)控中的重要作用，具有更高的“真實(shí)性”，為細(xì)胞增殖研究提供了新的靶點(diǎn)和直接有力的理論依據(jù)。隨著腫瘤增殖動(dòng)力學(xué)研究的不斷深入，Tiam1對(duì)細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)調(diào)控機(jī)制必將逐漸被闡明。同時(shí)，Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠作為具有自發(fā)高增殖活性的模式動(dòng)物，能夠?yàn)榧?xì)胞增殖與腫瘤演進(jìn)的深層機(jī)制研究提供新的理想平臺(tái)，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。