夏 紅，褚桂芬，楊 翔，楊 麗，胡金霞

(1.廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院婦科 511400；2.濱州醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東煙臺 264003)

宮頸癌是全世界女性中最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，我國宮頸癌的發(fā)生率和病死率占全球的1/3，嚴重威脅婦女的身心健康[1]。micro RNA(miRNA)作為一種新型腫瘤診斷的生物標志物，已成為學者們研究的熱點[2]。miRNA-21(miR-21)是發(fā)現(xiàn)較早、研究較多的一種miRNA，幾乎參與了所有惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]?？焖侔l(fā)育生長因子同源蛋白2抗體(SPRY2)是miR-21的調(diào)控靶點之一，其異常表達在腫瘤細胞的增殖及凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[4]。但是SPRY2在宮頸癌中的作用罕見報道，miR-21是否通過調(diào)控SPRY2的表達進而影響宮頸癌的增殖凋亡尚未有報道。鑒于此，本研究通過脂質體轉染來調(diào)節(jié)宮頸癌Siha細胞中miR-21的表達水平，探討miR-21對宮頸癌Siha細胞體外增殖、侵襲和凋亡的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織收集 采集2016年1月至2017年12月番禺區(qū)中心醫(yī)院收治患者的宮頸鱗癌組織22例，診斷結果均由2位病理醫(yī)師根據(jù)WHO分級診斷標準得出，患者均為新發(fā)病例，術前未接受過放化療。因子宮肌瘤或子宮脫垂在番禺區(qū)中心醫(yī)院住院并切除子宮，婦科檢查及病理檢查等排除宮頸疾病，術后獲得正常宮頸組織標本22例。標本采集后迅速放至液氮中冷凍，-80 ℃低溫保存。

1.1.2細胞及主要試劑 人宮頸鱗癌Siha細胞購自南京科佰生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自廣州易錦生物科技有限公司，Trizol 試劑購自日本寶生生物工程有限公司(大連)，PCR所需引物購自上海吉瑪制藥技術有限公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自武漢蓋云天生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC /PI 檢測試劑盒購自美國BD公司，SPRY2蛋白購自英國Abcam公司，BCA 蛋白定量試劑盒和HRP-羊抗兔IgG購自碧云天生物科技有限責任公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組及轉染 將宮頸鱗癌Siha細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞密度達80%～90%進行轉染，細胞在轉染前一天按2.0×105接種于6孔板中。采用LipofectamineTM2000脂質體法將miR-21模擬物(minic-21組)、模擬物對照寡核苷酸(minic-nc組)、抑制劑(inhibitor-21組)和抑制劑對照寡核苷酸(inhibitor-nc組)轉染至人宮頸癌Siha細胞。轉染后將細胞置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h進行后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，QPCR)檢測miR-21及SPRY2 mRNA水平 按照Trizol試劑使用說明書提取細胞總RNA，用超微量分光光度計對RNA濃度和純度進行檢測。按反轉錄試劑盒說明書采用特異性反轉錄引物反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，miR-21表達以U6為內(nèi)參，SPRY2表達以GAPDH為內(nèi)參進行QPCR檢測。miR-21引物貨號：上游HmiRQP0316，下游QP010-03。SPRY2上游引物：5′-GGACTGTGGCAAGTGCAAATGTA-3′；下游引物：5′-AAGGCACTGCTTGTCGCAGA-3′。GAPDH引物序列上游引物，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′；下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s擴增40個循環(huán)。反應結束后采用2-△△Ct法計算miR-21和SPRY2的相對表達。

1.2.3MMT法檢測細胞增殖 轉染48 h后，消化離心收集細胞，調(diào)整細胞密度為1×104/每孔接種于96孔板，每組設5個復孔。37 ℃培養(yǎng)1～4 h，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度值，計算細胞增殖指數(shù)。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 采用流式細胞術聯(lián)合Annexin Ⅴ-FITC /PI雙染法檢測凋亡率。細胞分組同上，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化各組細胞并得到單細胞懸液，PBS洗滌2次后，收集(1～5)×105個細胞，加入500 μL Binding buffer重懸細胞，之后分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC及5 μL PI 混勻，室溫避光反應15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡，具體操作步驟按說明書進行。

1.2.5Transwell分析細胞侵襲 細胞轉染48 h，將細胞饑餓12 h后制備細胞混懸液，并在無血清培養(yǎng)基中調(diào)整細胞密度為1×105/mL，然后將細胞懸液加入包被Matrigel膠的Transwell上室中，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)，細胞侵襲24 h，取出小室，將Trans well小室基底膜完整切除，用無菌棉拭子擦去上室內(nèi)細胞，多聚甲醛固定15 min，蘇木精染色10 min，顯微鏡下隨機取6個視野計數(shù)細胞侵襲數(shù)目，取平均值。

1.2.6Western blot檢測SPRY2蛋白的表達 轉染48 h后，收集待測細胞，用PBS洗3次，然后加入已添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解后提取總蛋白。等量的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉至PVDF膜。用5%的BSA進行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進行顯影拍照。

2 結 果

2.1miR-21和SPRY2 mRNA在宮頸癌組織中的表達情況 QPCR檢測結果顯示，miR-21在宮頸癌組織中的表達(2.543±0.474)明顯高于正常宮頸組織(0.766± 0.182)，SPRY2 mRNA在宮頸癌組織中的表達(0.076±0.012)明顯低于正常宮頸組織(0.988±0.383)，二者比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-21和SPRY2 mRNA在宮頸癌組織中表達呈負相關(r=-0.646 3，P=0.001 2)，見圖1。

1:正常宮頸組織；2：宮頸癌組織

圖1 miR-21和SPRY2在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達

2.2改變miR-21表達對宮頸癌Siha細胞增殖的影響 轉染miR-21mimic后，宮頸癌Siha細胞OD值(1.006±0.061)較minic-nc組(0.472±0.035)明顯升高；轉染miR-21 inhibitor后，宮頸癌Siha細胞OD值(0.338±0.023)較inhibitor-nc組(0.516±0.031)明顯降低，二者比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

***:P<0.05

圖2改變miR-21表達對宮頸癌Siha細胞增殖的影響

2.3改變miR-21表達對宮頸癌Siha細胞凋亡的影響 采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測Siha細胞的凋亡率。轉染48 h后，minic-21組細胞凋亡率為(16.55±0.05)%，低于minic-nc組的(31.00±1.80)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。inhibitor-21組轉細胞凋亡率為(68.60±1.90)%，高于inhibito-nc組的(47.10±2.60)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4改變miR-21表達對宮頸癌Siha細胞侵襲能力的影響 Transwell法檢測結果顯示，minic-nc組、minic-21組、inhibitor-nc組、inhibitor-21組的侵襲數(shù)目分別是101.500±8.872、194.000±6.885、101.000±7.389、41.830±5.029。與minic-nc組相比，minic-21組Siha細胞體外侵襲能力明顯提高(P<0.01)。與inhibitor-nc組相比，inhibitor-21組Siha細胞侵襲能力明顯下降(P<0.01)，見圖4。

A：柱狀圖；B：流式細胞儀記錄圖；*:P<0.05

圖3改變miR-21表達對Siha細胞凋亡率的影響

圖4 轉染miR-21后各組Siha細胞的侵襲情況(×100)

2.5改變miR-21表達對宮頸癌Siha細胞SPRY2 mRNA和蛋白表達的影響 分別采用QPCR和Western blot檢測各組細胞中SPRY2 mRNA和SPRY2蛋白的表達情況，實驗結果見表1，圖5。與minic-nc組相比，minic-21組SPRY2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，SPRY2 mRNA水平無明顯差異(P>0.05)；inhibitor-21組SPRY2 mRNA和蛋白水平均明顯高于inhibitor-nc組(P<0.01)。

表1 各組細胞SPRY2mRNA和蛋白的表達

*：P<0.05,與inhibitor-nc組比較；△：P<0.05,與minic-nc組比較

***:P<0.05

圖5改變miR-21表達對Siha細胞SPRY2mRNA和蛋白表達的影響

3 討 論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，每年新增10余萬例，近年來發(fā)病率有逐漸上升的趨勢。近期調(diào)查結果顯示，宮頸癌平均發(fā)病年齡為42歲，具有年輕化趨勢[5]。miRNA是一種由大約20個核苷酸構成的小型非編碼RNA。新近研究顯示，miRNA分子不僅可作為臨床腫瘤的診斷標記分子，也可作為臨床腫瘤基因治療的潛在新靶標[6]。miR-21是miRNA家族著名的癌基因明星，在多種腫瘤中高表達，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌、惡性膠質瘤、膀胱癌及頭頸部實體腫瘤等[7-8]，被開發(fā)為惡性腫瘤治療的潛在靶點[9]。文獻[10]報道，miR-21和miR-214在宮頸癌網(wǎng)絡中是核心生物學因素。miR-21在宮頸癌組織及相應細胞系中均為高表達[11]。在宮頸癌Hela細胞系中，下調(diào)miR-21表達，體外細胞的增殖能力受到顯著抑制[12]。在體外培養(yǎng)宮頸鱗癌細胞系中還發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過調(diào)節(jié)其靶基因CCL20的表達，來調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移等生物學過程[13]。因此，miR-21在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。

本研究采用QPCR檢測宮頸癌組織中miR-21的表達。結果表明，miR-21在宮頸癌組織中的表達顯著高于正常宮頸組織(P<0.05)，推測miR-21與宮頸癌的發(fā)生有關。但其作用機制尚未完全清楚。體外生長的Siha細胞是研究宮頸癌發(fā)病機制及評價治療策略的經(jīng)典細胞株。為此，本研究以人宮頸癌Siha細胞為研究對象，合成特異性miR-21 mimics和miR-21 inhibitor，然后轉染至Siha細胞中，通過調(diào)節(jié)miR-21的表達水平來觀察其對Siha細胞增殖、凋亡、侵襲以及對SPRY2表達的影響。本研究用MTT法觀察細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Transwell檢測細胞侵襲能力，結果顯示Siha細胞轉染miR-21mimics后，細胞的增殖能力明顯提高，凋亡能力明顯下降，侵襲能力明顯增強(P<0.05)；轉染miR-21 inhibitor后細胞的增殖、凋亡與侵襲能力變化相反(P<0.05)。說明miR-21可能通過促進細胞增殖、抑制凋亡及促進細胞侵襲能力，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用，miR-21分子可能成為宮頸癌基因治療的一個全新的靶點。

研究證實miR-21作為致癌基因，可通過下調(diào)抑制多種靶基因的表達，從而改變腫瘤細胞的生物學特性，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉歸等過程[14]。miR-21通過抑制PDCD4、PTEN、p53、Sox2、bcl2及PIK3R1等基因的表達，促進細胞的增殖和抑制其凋亡[15-16]。通過搜索Target Scan、Pictar及Microcosm數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)SPRY2是miR-21的調(diào)控靶點之一。SPRY2是sprouty家族4個成員(SPRY1～4)之一，在機體各器官廣泛表達[17]。有研究表明，SPRY2 蛋白表達與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、結直腸癌以及多發(fā)性骨髓瘤有關[4,18-19]。但是SPRY2在宮頸癌中的研究罕見報道，宮頸癌中miR-21是否通過調(diào)控 SPRY2 的表達進而影響宮頸癌的增殖和凋亡尚未有報道。

本研究采用QPCR檢測宮頸癌組織中SPRY2的表達，結果顯示SPRY2在宮頸癌中低表達(P<0.05)。進一步通過相關分析發(fā)現(xiàn)，miR-21和SPRY2的表達呈負相關(P<0.05)。接著本研究用QPCR和Western blot檢測了轉染miR-21后各組細胞中SPRY2 mRNA和蛋白表達情況。結果發(fā)現(xiàn)inhibitor-21組SPRY2 mRNA和蛋白水平均顯著高于inhibitor-nc組(P<0.05)，而minic-21組SPRY2蛋白水平明顯低于minic-nc組(P<0.05)，SPRY2 mRNA水平和minic-nc組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；提示miR-21與SPRY2蛋白質的水平存在顯著的負相關關系，而與SPRY2 mRNA的水平則無顯著相關，證實miR-21在蛋白層面對SPRY2發(fā)揮調(diào)控作用。miR-21可能是通過調(diào)控腫瘤抑制基因SPRY2的表達而發(fā)揮癌基因的作用。

本研究不足之處是未進行雙熒光素酶報告基因實驗，不能進一步證實SPRY2是miR-21的靶基因，需要通過相關實驗驗證并進一步闡明miR-21作用的分子機制。

綜上所述，miR-21在宮頸癌的發(fā)病中發(fā)揮了原癌基因的作用，且miR-21可能是通過調(diào)控腫瘤抑制基因SPRY2的表達而發(fā)揮作用的，提示miR-21分子可能成為宮頸癌基因治療的一個全新的靶點。