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        H2O2誘導建立HTR-8/SVneo胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應激模型

        2019-06-29 02:23:02李美和黨慧敏劉艷巧吳曉玲劉潤俠
        中國婦幼健康研究 2019年5期
        關(guān)鍵詞:氧化應激水平檢測

        李美和,黨慧敏,劉艷巧,吳曉玲,劉潤俠,安 鵬

        (1.西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科;2.婦產(chǎn)科,陜西 西安 710004)

        氧化應激(oxidative stress)是指活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成超出了機體內(nèi)抗氧化防御能力的不平衡狀態(tài)。過量的活性氧會損害細胞的脂類、蛋白質(zhì)或DNA,抑制其正常功能。因此,氧化應激與許多人類疾病都有關(guān)系。越來越多的證據(jù)顯示,氧化應激與流產(chǎn)、子癇前期等病理性妊娠的發(fā)生有密切關(guān)系[1-3]。在正常妊娠過程中,機體的氧化和抗氧化功能二者保持相對平衡,不會產(chǎn)生氧化應激[4-5]。然而,由于任何原因引起的人滋養(yǎng)細胞氧化損傷,都會使其增殖和侵襲能力下降,胎盤形成和發(fā)育異常,最終發(fā)生病理妊娠[6]。

        人胎盤滋養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞系是一種永生化的滋養(yǎng)細胞株,與人類原代滋養(yǎng)細胞具有許多相似的特性。因人類原代滋養(yǎng)細胞在培養(yǎng)過程中不能維持很長時間,故HTR-8/SVneo細胞系已成為研究胎盤功能和妊娠相關(guān)疾病的有用工具。本資料選取此細胞系作為研究對象,試圖通過采用不同濃度及不同時間的過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應激,找到建立HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應激模型的最佳條件,為研究人類妊娠病理性疾病奠定良好的基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1材料及儀器

        2017年11月至2018年2月于西安交通大學第一附屬醫(yī)院進行實驗,本研究采用一種永生化、孕早期、絨毛外滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo(由加拿大安大略省皇后大學Charles Graham博士提供)。

        DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液及0.25%胰酶購于美國GIBCO公司。H2O2購于美國Sigma-Aldrich公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)及過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本株式會社上海同仁化學研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒購于碧云天生物技術(shù)研究所;超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium,DHE)購于英國Abcam公司;PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

        1.2方法

        1.2.1細胞培養(yǎng)與處理

        在DMEM/F12培養(yǎng)基中對HTR-8/SVneo細胞進行培養(yǎng),加入10%滅活的胎牛血清和1%青鏈霉素混合液,在37°C、5%CO2中培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好時進行下一步實驗。

        1.2.2細胞形態(tài)觀察

        取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo細胞,以每孔1×105細胞種植于6孔培養(yǎng)板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后,實驗組分別給予不同終濃度的H2O2,分為50μmol/L H2O2組、150μmol/L H2O2組、300μmol/L H2O2組和500μmol/L H2O2組;同時設(shè)立對照組,相同實驗條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)1、3、6、12h,棄培養(yǎng)上清,PBS洗2遍,即放于相差倒置顯微鏡下,于相同的物鏡倍數(shù)(10×)觀察細胞形態(tài)學改變并拍照。

        1.2.3 CCK-8法檢測細胞存活率

        前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容,后棄培養(yǎng)上清,PBS洗2遍,加入提前配制的CCK-8工作液110μL(CCK-8溶液與培養(yǎng)基體積比為1:10),置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h,在自動酶標儀上檢測450nm波長處各孔吸光度(OD)值。按下述公式計算細胞存活率:存活率(%)=(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)×100%

        1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡

        前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容,后棄培養(yǎng)上清,冰冷的PBS洗2遍,用0.25%胰酶消化,收集細胞,800r/min離心5min,用100μL 1×loading buffer結(jié)合緩沖液重懸,分別加入5μL Annexin-V PE和5μL 7-AAD,混勻,室溫避光孵育15min,加入400μL 1×結(jié)合緩沖液,樣品置于冰上,1h內(nèi)用流式細胞儀(FACScanTM;Becton Dickinson Bioscience,加利福尼亞州圣何塞)檢測細胞凋亡情況。細胞分析采用配備的CellQuestTM軟件(Becton Dickinson生物科學)。

        1.2.5 DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平

        前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容,后棄培養(yǎng)上清,冰冷的PBS洗2遍,用1mL DHE(5μmol/L)重懸,37℃避光孵育30min,800r/min離心3min,冰冷的PBS洗2遍,用200μL PBS重懸,在流式細胞儀上進行檢測。用平均熒光強度(mean flourscenceindensity,MFI)表示ROS水平。

        1.2.6檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH含量及勻漿中SOD、CAT和MDA活性

        前期實驗條件同1.2.2內(nèi)容,后吸取培養(yǎng)上清,隨后按試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH含量及細胞勻漿中SOD、CAT及MDA活性。

        1.3統(tǒng)計學方法

        2結(jié)果

        2.1 CCK-8法檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞活力的影響

        HTR-8/SVneo細胞50μmol/L在H2O2作用1、3、6h后,細胞存活率分別為103.48%、101.68%、96.79%;150μmol/L在H2O2作用1、3、6h后,細胞存活率分別94.69%、96.4%、88.17%,較對照組100%的存活率無明顯變化(P值分別為0.99、1.00、0.98、0.86、1.00、0.55)。與對照組100%相比,50μmol/L在H2O2作用12h后細胞存活率有所下降(80.74%)(*P<0.05);300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h后,細胞損傷較重,且500μmol/L在H2O2作用后隨著時間增加,細胞損傷有加重趨勢,細胞存活率下降,分別為42.3%、32.77%、23.59%、12.85%;300μmol/L在H2O2作用3h后細胞存活率為76.78%,與對照組100%比較,細胞存活率明顯降低(F=7.793,**P<0.01),既達到細胞損傷狀態(tài),又存有一定的細胞活力,符合細胞實驗研究條件要求,見圖1。

        圖1CCK-8法檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞存活率的影響

        Fig.1EffectofH2O2onHTR-8/SVneocelllineactivityusing CCK-8method

        2.2 HTR-8/SVneo細胞形態(tài)學觀察

        50、150μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)無明顯改變,細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、細胞輪廓清晰;300μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞皺縮、間隙增寬,有些呈片狀壞死脫落,但仍存活相對較多細胞;500μmol/L H2O2組HTR-8/SVneo細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞皺縮變圓,間隙增大,體積變小相應減少,貼壁細胞明顯減少,大部分呈片狀壞死脫落,存活細胞較少,見圖2。

        圖2不同濃度3h的H2O2作用HTR-8/Svneo細胞的形態(tài)的影響

        Fig.2EffectofdifferentconcentrationsofH2O2oncellmorphologyafterculturingfor3hours

        2.3流式細胞儀檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響

        與對照組2.35%比較,50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h引起的HTR-8/SVneo細胞凋亡率僅有輕度增加(50μmol/L 1、3、6h細胞凋亡率分別為4.15%、5.18%、5.23%,150μmol/L 1、3、6h細胞凋亡率分別為4.91%、5.25%、6.15%),經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值分別為1.00、0.89、0.29、1.00、0.86、0.06);隨作用時間延長,300μmol/L H2O2組的細胞凋亡率不斷增加(均**P=0.00<0.01),其中300μmol/L在H2O2作用3h細胞凋亡率為25.05%,而300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h引起的細胞凋亡率呈快速上升趨勢(300μmol/L 6、12h細胞凋亡率分別為25.02%、39.05%,500μmol/L 3、6、12h細胞凋亡率分別為29.23%、44.05%、44.24%),雖然與對照組2.35%相比有顯著差異(F=196.500,均**P=0.00<0.01),但是其凋亡率較高,該處理對細胞損傷較大,導致細胞壞死,無法進一步研究使用,見圖3。

        注:A圖中,Control為對照組;A1~A4為50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;B1~B4為150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;C1~C4為300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;D1~D4為500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況。B圖為各組細胞存活率的定量分析。

        圖3流式細胞術(shù)檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞凋亡的影響

        Fig.3EffectofH2O2oncellapoptosisofHTR-8/SVneocellusingflowcytometry

        2.4 DHE熒光探針檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS水平的影響

        與對照組相比,H2O2對HTR-8/SVneo細胞MFI水平的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。與對照組12.63比較,50μmol/L及150μmol/L在H2O2作用1、3、6h,細胞MFI升高不明顯(50μmol/L 1、3、6h ,MFI值分別為12.76、13.59、15.50,150μmol/L 1、3、6h,MFI值分別為15.41、15.99、16.86)P值分別為1.00、0.72、0.66、0.77、0.56、0.41,均P>0.05 ),300μmol/L在H2O2作用3h的細胞MFI(17.95)明顯高于對照組的12.63(F=325.300,**P=0.00<0.01),但300μmol/L在H2O2作用6、12h,細胞MFI分別為19.24、24.11及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h,細胞MFI分別為19.82、34.57、42.26,造成大部分細胞死亡,細胞還存有很大的活力,有利于下一步的實驗,見圖4。

        A

        B

        注:A圖中,Control為對照組;A1~A4為50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;B1~B4為150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;C1~C4為300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況;D1~D4為500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情況。B圖為各組細胞內(nèi)超氧化物陰離子定量分析。

        圖4DHE熒光探針檢測H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)ROS水平的影響

        Fig.4EffectofH2O2onintracellularROSlevelofHTR-8/SVneocellusingDHEfluorescenceprobe

        2.5 H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD、MDA、CAT活力的影響及上清液中LDH活力的影響

        與SOD為31.32、LDH為355、MDA為1.20、CAT為16.87相比,50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h的HTR-8/SVneo細胞分別為1.21、1.35、2.68、1.38、2.36、3.54(P值分別為1.00、0.22、0.13、0.99、0.21、0.06,均P>0.05)和LDH分別為401、475、505、546、566、637水平升高不顯著(P值分別為1.00、0.29、0.19、0.99、0.24、0.10,均P>0.05),抗氧化SOD分別為30.78、27.33、25.27、23.57、23.27、20.34(P值分別為0.99、0.21、0.06、0.97、0.93、0.31,均P>0.05),CAT含量為17.21、16.34、14.25、13.24、10.01、9.87降低不明顯(P值分別為0.55、0.64、0.78、0.37、0.19、0.07,均P>0.05);與對照組相比,300μmol/L H2O2作用3、6、12h,500μmol/L H2O2作用3、6、12h均明顯降低了細胞培養(yǎng)上清液中SOD、CAT的活性,同時升高了MDA和LDH水平的表達(SOD分別為14.34、10.01、9.88、9.55、7.22、5.87;LDH分別為628、688、715、742、809、880;MDA分別為4.30、4.55、5.27、5.25、5.83、6.10;CAT分別為5.68、5.01、4.33、6.00、4.01、3.21)(SOD:F=12.210,LDH:F=11.830,MDA:F=12.730,CAT:F=17.720,均**P=0.00<0.01),其中300μmol/L H2O2組作用3h,細胞中LDH為628.00、MDA為4.30,含量升高明顯,細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性為14.37、CAT活性為5.68,但與6、12h及500μmol/L作用3、6、12h相比,其嚴重損傷水平較低,見圖5。

        注:A為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD活性的影響;B為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)LDH含量的影響;C為H2O2對 HTR-8/SVneo細胞內(nèi)MDA水平的影響;D為H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)CAT水平的影響。

        圖5H2O2對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)SOD活性、LDH含量及MDA和CAT水平的影響

        Fig.5EffectofH2O2onintracellularSOD,LDH,MDAandCATlevelsinHTR8-SVneocell

        3討論

        成功妊娠是一個非常復雜的過程,不僅需要母體免疫系統(tǒng)不排斥作為同種移植物的胎兒,還需要早孕期滋養(yǎng)細胞具有尤為重要的生理學功能,其中滋養(yǎng)細胞增殖與侵襲功能的正常發(fā)揮對于囊胚植入、胎盤的形成并建立合適的母-胎關(guān)系至關(guān)重要。氧化應激在各種妊娠生殖疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。氧化應激損傷時滋養(yǎng)細胞凋亡常與過量的ROS產(chǎn)生[7-9]有關(guān)。因此,抑制氧化應激所致的氧化損傷和凋亡是妊娠疾病的重要干預策略。由于H2O2作用于細胞會產(chǎn)生高度活性的自由基,導致細胞氧化,因此H2O2被廣泛應用于建立細胞氧化應激模型中[10]。故本研究利用HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞與H2O2共同孵育,以期建立氧化應激損傷模型。

        3.1ROS在氧化應激中的作用

        ROS作為有氧能量代謝的產(chǎn)物,其生理濃度的維持主要受SOD、CAT、LDH、MDA活性及谷胱甘肽、維生素C和維生素E濃度的影響[11-12]。當這個系統(tǒng)失去平衡時,產(chǎn)生的不完全對立的ROS會導致線粒體功能的改變、蛋白質(zhì)活性的降低、核酸損傷及誘導凋亡。隨后不同的器官系統(tǒng)表現(xiàn)出組織損傷等一系列病理過程[13-15]。近年的研究結(jié)果顯示,缺乏充分調(diào)控的ROS被認為是導致胎盤病理、妊娠紊亂和早產(chǎn)的主要原因[16-21]。本研究結(jié)果顯示,300、500μmol/L H2O2組明顯提高了細胞ROS的水平,其中300μmol/L H2O2作用3h不僅在一定程度上增加了ROS水平(P<0.01),且保證了細胞的活力;而300μmol/L H2O2在6、12h及500μmol/L H2O2在1、3、6、12h雖明顯增加了ROS的水平,但同時造成了細胞的大量死亡。此外,細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以對抗氧化應激,其中包括不同的自由基清除抗氧化酶和非酶抗氧化劑。SOD和CAT被認為是最重要的抗活性氧酶。SOD將超氧轉(zhuǎn)化為H2O2,然后CAT將H2O2分解為水和氧氣。SOD、CAT等細胞抗氧化酶可降低細胞內(nèi)ROS含量[22-23],而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可間接反映氧化應激下ROS的生成[24]。MDA作為細胞脂質(zhì)氧化最重要的產(chǎn)物,可加重細胞膜的損傷,反映細胞膜系統(tǒng)的損傷程度。LDH是一種糖酵解酶,是細胞質(zhì)膜完整性的指標,存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi),在生理狀態(tài)下不能穿透細胞膜,但當細胞膜發(fā)生損傷時,LDH從細胞內(nèi)漏入細胞外基質(zhì)[25],其含量是評價有機抗氧化能力的重要因素。本研究結(jié)果表明,經(jīng)H2O2作用后的實驗組,其細胞SOD及CAT水平較對照組均有明顯的減少,而LDH、MDA含量較對照組均有明顯的提高(均P<0.01)。由此表明,這些細胞抗氧化劑在清除自由基和維持氧化還原平衡方面亦發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時,經(jīng)比較分析各實驗組后顯示,300μmol/L H2O2組3h既能增加細胞MDA和ROS的生成,降低抗氧化酶活性,同時還出現(xiàn)SOD和CAT含量明顯下降,提示H2O2有改變細胞內(nèi)自由基水平的能力,造成細胞氧化應激損傷,符合細胞氧化應激模型條件的要求。

        3.2細胞凋亡參與氧化應激損傷

        細胞凋亡是細胞死亡途徑的一種程序化和活躍的模式,在正常的生理或病理環(huán)境中受自身基因的調(diào)控[26]。由于氧化應激損傷和細胞凋亡存在潛在相關(guān)性,故觀察了H2O2作用后的HTR-8/SVneo細胞是否也具有細胞凋亡增加的現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明,300μmol/L H2O2作用于人胎盤滋養(yǎng)細胞后,細胞凋亡率相比對照組明顯增加,且隨著作用時間及濃度的增加,細胞凋亡率明顯上升,故表明H2O2對人胎盤滋養(yǎng)細胞有明顯的損傷作用(P<0.01),其參與了細胞凋亡的過程。

        綜上所述,H2O2可以通過增加細胞ROS和MDA的生成,降低細胞SOD、CAT和LDH水平,抑制抗氧化酶的活性,導致HTR-8/SVneo胎盤滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應激及細胞凋亡。比較H2O2不同作用時間及濃度后,明確300μmol/L H2O2在3h條件下HTR-8/SVneo人胎盤滋養(yǎng)細胞既可以發(fā)生明顯的氧化應激及細胞凋亡,同時細胞仍具有一定的存活率,故可作為人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應激模型應用于各種妊娠病理疾病的研究中。

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