步俊彥 臧德奎

摘要 根據(jù)山東栒子葉片多糖多酚多毛的理化性質(zhì)，研究適合山東栒子便捷高效的基因組DNA提取方法。結(jié)果獲得了純度高、質(zhì)量符合后續(xù)分子標(biāo)記和遺傳多樣性分析要求的基因組DNA。采用6個(gè)不同種群的樣品，利用150對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，確定了最佳反應(yīng)體系為2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5? μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物0.5? μL，dd H2O 10.5? μL，共篩選出11對(duì)多態(tài)性相對(duì)良好、條帶較為清晰的引物組合。該研究為以后SRAP分子標(biāo)記在栒子屬植物遺傳多樣性方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 DNA提取;山東栒子;SRAP;引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào) S188+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0097-04

Abstract According to the physicochemical properties of polysaccharide polyphenols and hypertrichiasis from Cotoneaster schantungensis，a convenient and efficient genomic DNA extraction method suitable for C.schantungensis was studied.The obtained genomic DNA was of high purity and the quality was sufficient to satisfy the requirements of subsequent molecular marker experiments.For 6 plant samples from different populations，150 pairs of SRAP primer combinations were used to screen，and 2×EsTaqMasterMix （containing dye） 12.5? μL，40 ng/μL DNA template 1? μL，10 pmol/μL primer 0.5? μL，dd H2O 10 .5? μL of good system and 11 pairs of wellcharacterized bands with clear primer combinations were determined.This series of experiments laid the foundation for the experimental study of genetic diversity of SRAP molecular markers for the C.schantungensis and Cotoneaster genus species.

Key words DNA extraction;Cotoneaster schantungensis;SRAP;Primer screening

山東栒子（Cotoneaster schantungensis）隸屬薔薇科栒子屬，是山東特有樹(shù)種[1]，已列入山東珍稀瀕危保護(hù)樹(shù)種名錄。過(guò)去僅生長(zhǎng)于濟(jì)南南部山區(qū)，種群數(shù)量少，屈素青[2]對(duì)16份野生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，但樣品數(shù)過(guò)少。近年來(lái)在泰山、徂徠山、魯山等地發(fā)現(xiàn)了與山東栒子表型極為相似的栒子屬種群，需要通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步鑒定其分類(lèi)歸屬。分子標(biāo)記技術(shù)因其方法相對(duì)簡(jiǎn)便、多態(tài)性高、成本低且滿(mǎn)足多種遺傳分析等優(yōu)點(diǎn)，成為目前種質(zhì)資源鑒定的高效技術(shù)手段之一[3-5]。迄今為止，遺傳基因檢測(cè)中常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RFLP、RAPD、AFLP、CDDP、SSR等，各種分子標(biāo)記技術(shù)的復(fù)雜程度、穩(wěn)定性及產(chǎn)生遺傳信息的能力不同，各自具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。而SRAP作為功能序列擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)[6]，因其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和相對(duì)較易得到選擇條帶序列的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于棉花[7]、西瓜[8]、黃瓜[9]、菊花[10]等植物的遺傳多樣性研究。

筆者利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)39份山東栒子樣品以及50個(gè)表型相似的疑似山東栒子樣品進(jìn)行分析，在分子水平上驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)栒子種群的歸屬，更進(jìn)一步深入分析山東栒子的遺傳多樣性，從而推動(dòng)瀕危植物山東栒子的保護(hù)與利用。由于栒子類(lèi)植物葉片中含有多種次生代謝物質(zhì)，如酚類(lèi)、多糖等，且還有表面多毛、細(xì)胞壁較厚等特點(diǎn)，胞內(nèi)物質(zhì)很難被裂解出來(lái)，多蛋白多雜質(zhì)，DNA易降解而RNA難去除等，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)證明，無(wú)法利用最常用的改良CTAB法提取DNA。因此，選擇適合山東栒子的方法以去除這些因素對(duì)DNA質(zhì)量的影響極其重要[11-12]。該試驗(yàn)旨在找出最便捷高效的山東栒子基因組DNA提取方法，篩選出高質(zhì)量的SRAP引物，為驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)栒子屬植物歸屬及山東栒子的遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為采自山東泰山、徂徠山、佛峪、紅葉谷、魯山等地的89份樣品，采集幼葉后，立即加入硅膠干燥，密閉儲(chǔ)存于干燥黑暗環(huán)境以待備用。

1.2 試驗(yàn)儀器

研磨儀，低溫高速離心機(jī)，電泳儀，水浴鍋，紫外分光光度計(jì)，凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 試劑

CTAB緩沖液（配方見(jiàn)表1），氯仿-異戊醇（V∶V=24∶1），無(wú)水乙醇，70%乙醇，1×TE，雙蒸水（ddH2O），NaAc。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 準(zhǔn)備工作。①準(zhǔn)備高壓蒸汽滅菌離心管、移液器槍頭、提取介質(zhì)、直徑2 mL的小鋼珠等;②將離心管（2.0、1.5 mL）標(biāo)好對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào);

③打開(kāi)水浴鍋預(yù)熱，將CTAB緩沖液放于水浴鍋中水浴預(yù)熱備用。

1.4.2 山東栒子DNA的提取。

①稱(chēng)取樣品0.2 g干燥葉片加入到2 mL離心管中，再加入3～5個(gè) 2 mm直徑的小鋼珠，蓋緊離心管蓋子。放入液氮桶中進(jìn)行預(yù)冷。②將研磨機(jī)12孔圓盤(pán)用鑷子夾住浸入液氮桶預(yù)冷，注意不要沒(méi)過(guò)圓盤(pán)上端塑料片。

③將預(yù)冷后的離心管用鑷子加入研磨盤(pán)中，以50 hz的頻率研磨5 min，鑷子取出磨樣盤(pán)浸入液氮桶預(yù)冷30 s，繼續(xù)以50 hz的頻率研磨5 min。

④加入預(yù)先在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱好的1 mL CTAB緩沖液，用振蕩器搖勻后水浴15 min，每5 min左右輕輕上下?lián)u勻。⑤取出離心管待冷卻至室溫后，放入離心機(jī)中，并以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速在常溫下離心15? min。⑥準(zhǔn)備新的2 mL離心管，寫(xiě)好編號(hào)。離心結(jié)束后，將離心管取出，抽取上清液共800? μL（少量多次抽取，每次取上清液200? μL，800? μL為上限）于新的2 mL離心管內(nèi)，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），輕輕搖動(dòng)離心管，直至管內(nèi)液體上下不分層，即反應(yīng)液混合均勻。

⑦將離心管再次放入離心機(jī)中，在低溫模式4 ℃下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，離心結(jié)束后觀(guān)察離心管中間的白色蛋白層，如果中間蛋白質(zhì)較多，需再次利用氯仿-異戊醇再次抽提剩余蛋白質(zhì)雜質(zhì)，直至中間白色蛋白層基本消失。

⑧準(zhǔn)備一支新的1.5 mL離心管，編號(hào)。將400? μL上清液用有黃色平底槍頭（每次100 μL）轉(zhuǎn)移到1.5? mL離心管中。先加入1/10體積的3 mol/L NaAc試劑于上清液中，然后再加入2倍體積的-20 ℃無(wú)水乙醇，放入冰箱-20? ℃保存1 h以上待DNA凝結(jié)析出，再以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速在低溫離心機(jī)4 ℃下離心3～5 min。

舍棄上清液，用約1 000? μL的70% 乙醇充分洗滌管底沉淀，輕彈管底使DNA與管底脫離以便充分洗滌，但注意不要將DNA彈散，輕輕搖動(dòng)2～3次后，靜置5 min，小心倒出乙醇后再重復(fù)此步驟2～3次，用移液器輕輕將剩余乙醇吸除后，將離心管開(kāi)蓋在避自然光室溫下放置約3～4 h，或放置于37 ℃烘箱至烘干。

⑩將沉淀于50? μL的1×TE內(nèi)溶解，并儲(chǔ)存在4 ℃ 冰箱中（如若長(zhǎng)期儲(chǔ)存需放置在-20 ℃）。

1.4.3 山東栒子DNA質(zhì)量檢測(cè)。

針對(duì)山東栒子RNA難去除的特點(diǎn)，增加RNAase用量，延長(zhǎng)水浴時(shí)間。將5? μL RNAase加入至提取的DNA樣品中，輕輕搖勻，將混合好的DNA溶液置于37 ℃水浴鍋中水浴1.5 h，目的在于完全去除DNA溶液中的RNA。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：配制1%瓊脂糖凝膠，利用gelred核酸燃料進(jìn)行染色，凝結(jié)為固態(tài)膠后將膠置于電泳槽內(nèi)，將5 μL除去 RNA的 DNA溶液和1? μL Loading Buffer的混合溶液依次點(diǎn)入瓊脂糖凝膠孔中，然后在120V電壓下電泳30 min，最后凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察、拍照。通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和質(zhì)量：當(dāng)A260/280<1.8，表明其可能受到蛋白（芳香族）或酚類(lèi)等物質(zhì)的污染，需要進(jìn)一步純化樣品，當(dāng)A260/280>2.0，表明其原因可能是最終提取DNA產(chǎn)物中RNA未去除充分。

1.4.4 山東栒子SRAP分子標(biāo)記引物篩選。

從佛峪、紅葉谷、泰山、徂徠山、魯山、抱犢崮6個(gè)地區(qū)的栒子基因組DNA中各挑選一個(gè)質(zhì)量較高的DNA樣品，利用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP引物參照Li等[4]的方法，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表2）。將上游和下游引物組合搭配共形成150對(duì)（山東栒子）引物組合，從中篩選出擴(kuò)增條帶較為清晰、豐富、穩(wěn)定的引物組合，以用于后期試驗(yàn)的正式擴(kuò)增。在經(jīng)過(guò)多次反應(yīng)體系試驗(yàn)調(diào)試后，確定了穩(wěn)定性相對(duì)較為良好的PCR擴(kuò)增體系：2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5 μL，40 ng/μLDNA模板1 μL，10 pmol/μL引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。

采用25 μL PCR 反應(yīng)體系，SRAP-PCR擴(kuò)增在 Bio-Rad PCR儀（My Cycler）上完成。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5? min;94 ℃變性1 min，35 ℃退火1? min，72 ℃延伸1? min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);94 ℃變性1? min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1? min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)：將6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)于被gelred核酸染料染色的2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，在5V/cm的電壓下進(jìn)行電泳，1.5～2.0 h，電泳完成后，在凝膠成像分析儀上進(jìn)行觀(guān)察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東栒子基因組DNA的提取

在改良DNA CTAB提取法的基礎(chǔ)上，配制了新的綜合CTAB提取緩沖液，在提取方法上也做了進(jìn)一步的改良，且在一定程度上縮短了DNA提取時(shí)間，大大提高了提取效率。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，DNA條帶清晰，拖尾輕，無(wú)明顯降解，完整性良好，表明新一代改良CTAB法能夠更有效、更快速、更便捷地提取瀕危植物山東栒子的DNA。

經(jīng)檢測(cè)，所提取的山東栒子基因組DNA的A260/280在1.66～1.84， DNA濃度在800～2 700 ng/μL，說(shuō)明該試驗(yàn)所提取的DNA質(zhì)量和產(chǎn)率均較高，足夠滿(mǎn)足SRAP-PCR對(duì)DNA的質(zhì)量要求。這表明新一代改良CTAB提取DNA法能夠有效地提取質(zhì)量相對(duì)較高的栒子屬基因組DNA。

2.2 山東栒子SRAP引物篩選

通過(guò)利用150對(duì)引物對(duì)選擇出來(lái)的6份DNA材料進(jìn)行擴(kuò)增，并根據(jù)二元性狀編碼法統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增出的引物位點(diǎn)。舍棄未擴(kuò)增出來(lái)?xiàng)l帶，或擴(kuò)增出條帶相對(duì)較少且多態(tài)性條帶較少，或者擴(kuò)增出條帶較多但多態(tài)性條帶較少的引物，最終得出11對(duì)（表3）多態(tài)性相對(duì)較好、條帶較為清晰的引物組合，用于后續(xù)的SRAP分子標(biāo)記試驗(yàn)（圖2）。其中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶數(shù)最多的引物組合為EM4-EM11，多態(tài)性條帶共有14條，最少的為ME8-EM9，多態(tài)性條帶僅6條;引物組合ME4-EM11多態(tài)性最好，達(dá)93.33%，多態(tài)性最差的為ME6-EM12，僅為43.75%。

3 結(jié)論與討論

植物基因組DNA的提取質(zhì)量已成為分子標(biāo)記試驗(yàn)是否成功的重要因素。由于植物的理化性質(zhì)不同，因此需要選擇適宜且更加高效便捷的DNA提取方法尤為重要[13]。由于山東栒子多糖多酚的特點(diǎn)，其細(xì)胞壁較厚難以裂解，DNA易

降解而RNA難去除的特點(diǎn)，難以獲得適用于分子標(biāo)記試驗(yàn)的高純度、高質(zhì)量的基因組DNA，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)不斷研究探索后，在進(jìn)一步改善了傳統(tǒng)使用的改良CTAB提取DNA方法。選擇利用研磨機(jī)以高頻率充分研磨樣品葉片，加速細(xì)胞的裂解，與普通加液氮利用研缽磨樣相比，研磨機(jī)研磨2次并增加沁入液氮預(yù)冷次數(shù)，使整個(gè)研磨過(guò)程均能在低溫環(huán)境下進(jìn)行，降低操作和環(huán)境的影響，以保證研磨充分的同時(shí)也可以避免DNA降解;提取緩沖液中加入10%PEG 8000改變了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞通透性以加快細(xì)胞膜的破裂;提高CTAB濃度以增加DNA提取效率;加入CTAB后，延長(zhǎng)水浴時(shí)間，可以重分裂解細(xì)胞膜，使膜內(nèi)物質(zhì)完全釋放;增加氯仿-異戊醇抽提的次數(shù)，可以相對(duì)減少蛋白質(zhì)雜質(zhì)對(duì)DNA純度的影響;用乙醇洗滌沉淀前加入3 mol/μL的NaAc 溶液以去除多糖;增加RNAase用量，適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間以充分去除DNA中的RNA雜質(zhì)。簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作過(guò)程，縮短試驗(yàn)時(shí)間，減少了試驗(yàn)過(guò)程中DNA降解的可能性也在一定程度上提高了試驗(yàn)效率。SRAP作為一種針對(duì)功能序列擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、易于獲得選擇條帶序列的特點(diǎn)。每個(gè)采樣種群中均選擇一個(gè)基因組DNA質(zhì)量較高的樣品DNA，并利用150個(gè)引物進(jìn)行篩選，最終確定：2×EsTaqMasterMix（含染料）12.5 μL，40 ng/μLDNA模板1 μL，10 pmol/μL引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL的反應(yīng)體系，篩選出11對(duì)多態(tài)性較好的引物組合，其中多態(tài)性最好的為ME4～EM11，多態(tài)性高達(dá)93.33%，多態(tài)性最差的為ME6-EM12，多態(tài)性?xún)H為43.75%。

該研究表明，新一代改良的CTAB提取方法在針對(duì)多糖多酚多雜質(zhì)的植物基因組DNA的提取上具有良好可行性;SRAP分子標(biāo)記引物篩選試驗(yàn)研究結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記在栒子屬植物遺傳多樣性分析研究中效果較好，為山東栒子甚至栒子屬的分子學(xué)研究奠定良好基礎(chǔ)。

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