任雪羽，王曉紅，肖 芬，周 英

(中南林業(yè)科技大學 風景園林學院,湖南 長沙 410004)

簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性，又稱ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標記技術(shù)，是在PCR反應的基礎(chǔ)上，利用PCR擴增進行樣本檢測的DNA分子標記[1]。具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡單、重復性好、信息量大等優(yōu)點[2]，現(xiàn)已廣泛運用于植物遺傳多樣性檢測[3-5]、親緣關(guān)系分析[6-8]、品種鑒定[9-11]及誘變育種材料的鑒定與選擇[12-14]研究中。木槿(HibiscussyriacusL.)為錦葵科木槿屬植物，開花于少花的夏秋季節(jié)，花大色艷，花期長，是優(yōu)良的園林觀花樹種，兼具藥用與食用價值。目前，國內(nèi)主要研究集中在木槿繁殖技術(shù)[15-16]、抗性水平[17-18]等方面，對木槿的分子生物學研究較為落后。鑒于此，探索適宜木槿各品種的ISSR-PCR反應體系并進行優(yōu)化，為開展木槿分子水平研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 于湖南省長沙市中南林業(yè)科技大學木槿苗圃中，采集紫花單瓣、馬麗娜、白綢、玫瑰紅、中國薄綢、紫玉、牡丹木槿、木橋、大白花、薰衣草、哈馬博、雅致木槿、薰衣草薄綢、白花重瓣、紫柱、藍鳥、紅心、千層紅、紅暈、花斑、漢桑、阿娘、茹碧、忠武等24個木槿品種(編號分別為CK和1—23)的頂芽向下第2～4片葉片進行試驗。采摘后放入液氮中備用。

1.1.2 生化試劑 320高效植物基因組提取試劑盒(DP320)購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖、Gene Green核酸染料、Taq酶(R001AM)均購自Takara寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司2006 年公布的引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測 使用天根320高效植物基因組DNA 提取試劑盒提取葉片DNA[19]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的完整性，采用BIO-RAD Doc-2000自動凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化 以紫花單瓣木槿DNA為模板，以初步篩選的UBC899號引物，即5′-CATG(GT)2TGGTCATTGTTCCA-3′，作為固定引物，對影響ISSR-PCR擴增的主要參數(shù)進行L16(45)正交試驗設計(表1)，每個處理重復2次。各處理總體積為25 μL，均加入2.5 μL 10×buffer(Mg2+free)，不足用超純水補足。

表1 ISSR-PCR反應體系中各因素的配比設置

在PCR儀(BIO-RAD S1000 Thermal Cycler)上設置擴增程序為：94 ℃預變性2 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保溫。

根據(jù)正交試驗篩選出的最優(yōu)組合進行退火溫度單因素試驗。溫度設置以引物Tm值為基準上下浮動1～2 ℃。設置了50～60 ℃的退火溫度區(qū)間。

1.2.3 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測 將10 μL擴增產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混勻，加入1.2%瓊脂糖凝膠點樣孔中。電壓110 V，電泳25 min后于自動凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。對各組擴增條帶打分：條帶表現(xiàn)清晰穩(wěn)定，多態(tài)性高，記16 分；沒有條帶，記1 分。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用EXCEL對正交試驗的分值進行直觀分析，求出同一因素同一水平下的均值ki，及同一因素不同水平下平均值的極差R值。用SPSS 22.0進行正交試驗因素間的方差分析及Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取效果分析

通過凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)提取的木槿DNA質(zhì)量較好，亮度高，主帶清晰，無拖帶(圖1)，符合后續(xù)PCR擴增要求。

圖1 部分木槿品種基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Detection of genomic DNA of some materials by electrophoresis

2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化

2.2.1 PCR正交試驗直觀分析 如圖2所示，在16個反應組合中，第5、6、9、10組沒有擴出條帶，其余組合均擴增出可見條帶。

極差R值反映不同因素對PCR擴增結(jié)果的影響程度。R越大，影響越顯著。由表2可以看出，各因素對木槿ISSR(25 μL)反應體系的影響依次為：Mg2+濃度>Taq酶用量>dNTPs濃度>模板DNA用量>引物濃度。平均值ki則反映了因素在該水平下對反應體系的影響程度。結(jié)合圖2可直觀看出，16個組合中，第8組擴增效果最好，其直觀分析分值最高。為了進一步確定木槿PCR體系的最優(yōu)組合，進行方差分析。

泳道1—16分別對應表1正交組合編號;M.D2000 Marker

2.2.2 PCR正交試驗方差分析 方差分析結(jié)果表明，Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度的P小于0.01(表3)，即Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度對木槿PCR反應體系有極顯著影響。模板DNA用量和引物濃度的P大于0.05，則二者對PCR體系無顯著影響。同時，由F值可知，Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度三因素對反應體系的重要性與直觀分析一致，可對三因素進行多重比較。

表2 不同因素影響下PCR擴增結(jié)果直觀分析

表3 不同因素影響下PCR擴增結(jié)果方差分析

續(xù)表3 不同因素影響下PCR擴增結(jié)果方差分析

注：**代表在0.01水平差異顯著。

Note：** means significant difference at 0.01 level.

Mg2+濃度對反應體系的影響最大，且隨濃度增加而上升，當濃度為2.0 mmol/L時均值最高(圖3)。同時從泳道條帶擴增有無的情況可直觀看出Mg2+濃度對于PCR反應體系的重要性，以2.0 mmol/L Mg2+為該體系中最佳水平。

Taq酶用量在PCR反應體系中的影響水平僅次于Mg2+濃度。Taq酶用量過高或過低均易產(chǎn)生非特異性條帶，致使條帶減弱，清晰度下降[20]。故從經(jīng)濟角度出發(fā)，選擇0.75 U為Taq酶最佳反應用量。

dNTPs濃度為0.10 mmol/L時與其余三水平有極顯著差異，且均值隨dNTPs濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(圖3)。從電泳結(jié)果來看，泳道2、8、11、13均能擴出較為清晰的條帶。故可認為，0.10 mmol/L dNTPs為最佳水平。

圖3 不同Mg2+濃度、Taq酶用量、dNTPs濃度下估計邊際平均值多重比較分析Fig.3 Multiple comparative analysis of estimated marginal mean values at different Mg2+ concentration, Taq enzyme dosage and dNTPs concentration

2.2.3 退火溫度對木槿ISSR-PCR反應體系的影響 50～60 ℃的退火溫度區(qū)間擴增結(jié)果如圖4所示，以泳道G、H兩者最佳，即50.9、50.0 ℃。其中,50.0 ℃下電泳的條帶清晰，亮度高，故選擇50.0 ℃作為最佳退火溫度。

2.3 木槿最佳ISSR-PCR反應體系和反應程序的驗證

以紫花單瓣木槿為對照，對建立的ISSR-PCR反應體系并隨機引物UBC 822號進行24個木槿品種擴增驗證，電泳結(jié)果如圖5所示。擴增條帶清晰穩(wěn)定，無拖帶，多態(tài)性高。證明所得反應體系與反應程序?qū)δ鹃染哂羞m宜性與穩(wěn)定性。

A—H泳道退火溫度分別為60.0、59.3、58.1、56.3、54.0、52.3、50.9、50.0 ℃;M.D2000 Marker

圖5 最佳反應體系并隨機引物UBC822號對24個木槿品種的擴增結(jié)果Fig.5 Amplification of 24 Hibiscus species by the optimal reaction system with random primer UBC822

3 結(jié)論與討論

目前， ISSR-PCR試驗條件常用的優(yōu)化方法有2種，即單因子優(yōu)化法和正交試驗優(yōu)化法[20]。單因子優(yōu)化法是對各影響因素單獨研究，擁有操作簡單快捷的優(yōu)點，但工作量大，不能兼顧各影響因素之間的相互作用，故運用較少；而正交試驗法，在減少試驗次數(shù)與工作量的同時，可均衡分散、綜合各因素對結(jié)果的影響，是一種高效率、快速、經(jīng)濟的試驗設計方法，能夠較快地找到最優(yōu)水平組合[21]。

本試驗綜合運用了2種試驗方法，分析了各因素對木槿ISSR-PCR體系的影響，最終得出了適宜木槿ISSR-PCR的反應體系(25 μL)：10×buffer(Mg2+free)2.5 μL、Taq酶0.75 U、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物濃度0.5 μmol/L。最佳退火溫度為50.0 ℃。