郭曉陽，何太學(xué)，代丹丹，胡 穎，余彥鴿，理向陽，江海東，郭紅霞

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州450002； 2.創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)有限公司，廣東 深圳 518048； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095)

黃瓜作為我國蔬菜生產(chǎn)中主要的蔬菜種類之一，在國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，黃瓜一般采取的是穴盤育苗后移栽定植，這種生產(chǎn)方式導(dǎo)致移栽后幼苗出現(xiàn)緩苗期，且時間較長，從而影響黃瓜的產(chǎn)量。針對作物移栽后出現(xiàn)緩苗期的現(xiàn)象，之前很多學(xué)者圍繞著土壤溫度不適[1]、根系受到破壞[2]等方面進(jìn)行了大量的研究。

生物體受到刺激或干擾后，小分子代謝物的組成和含量會發(fā)生變化。這些內(nèi)源代謝物對植物的正常生長及發(fā)育起到極為重要的作用，種類包括對植物生命活動所必需的初生代謝物，以及種類更為廣泛、數(shù)量更為巨大的次級代謝產(chǎn)物。在生長發(fā)育過程中，任何外界因素的變化，包括育苗移栽以及炎熱、寒冷、干旱、洪澇等氣候變化，作物體內(nèi)所產(chǎn)生的相關(guān)小分子代謝物質(zhì)會有所不同；即使對同一種植物而言，在不同的生長時期或者發(fā)育階段，代謝產(chǎn)物的種類及含量也會發(fā)生變化[3-4]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一種組學(xué)技術(shù)。利用代謝組學(xué)的手段，對豆科植物百脈根(Lotusjaponicus)進(jìn)行了代謝物質(zhì)分析，從代謝水平上明確了百脈根的抗旱機制[5]。KUSANO等[6]對正常野生型擬南芥以及黃酮或者芥子?；O果酸合成途徑異常的突變體擬南芥進(jìn)行了代謝組學(xué)比較分析研究，對這2種不同基因型的樣品在紫外輻射條件下進(jìn)行光照24、96 h處理，結(jié)果表明,短期光照處理(24 h)的擬南芥可以分泌一些次級代謝產(chǎn)物來吸收紫外輻射產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。代謝組學(xué)研究包括指紋圖譜、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)以及核磁共振等方法。KATI等[7]利用超高液相色譜-單四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀檢測手段對草莓的花瓣、花蕊、花萼、花托進(jìn)行了無目標(biāo)性的代謝指紋圖譜分析，結(jié)果顯示，一些花青素類、黃酮類、萜類等次級代謝產(chǎn)物及其派生物在各個器官組織中分布規(guī)律不同，明確了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生種類與功能性器官之間的對應(yīng)關(guān)系。植物代謝組學(xué)在擬南芥、馬鈴薯、番茄、煙草、大豆、花生、大麥、萵苣上的研究都集中在水分脅迫、溫度脅迫方面[8-12]。針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上由于育苗移栽引起的緩苗期現(xiàn)象，目前尚未發(fā)現(xiàn)從體內(nèi)小分子代謝物的角度進(jìn)行研究的報道。鑒于此，從代謝組學(xué)的角度研究不移栽與移栽處理黃瓜葉片中代謝產(chǎn)物種類及數(shù)量的變化，篩選出不移栽與移栽相比差異較大的生物標(biāo)記物，從代謝組學(xué)水平對緩苗期出現(xiàn)的原因進(jìn)行探索，為調(diào)控緩苗期研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：乙腈、甲醇(質(zhì)譜純，F(xiàn)isher Scientific,USA)、甲酸(色譜純，F(xiàn)isher Scientific,USA)。

主要儀器：超高液相色譜-單四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF)(Xevo G-2,Waters,USA)、Masslynx 工作站(Version 4.1,Waters,USA)、色譜柱(C181.7 μm，2.1 mm×100 mm，Waters,USA)、超聲波提取機(KQ-3200DE,昆山市超聲儀器有限公司)、純化水系統(tǒng)(Milli-Q，Milli-Q INC.， USA)、高速離心機(MULTIFUGE X1R,Thermo Scientific,USA)、電子天平(FA2004B,上?？朴觾x器儀表有限公司)。

1.2 供試材料

將50孔育苗盤鋪上基質(zhì)[V(草炭)∶V(蛭石)=1∶3]，基質(zhì)相對濕度為70%，然后將市售黃瓜種子單粒播種于育苗盤中，上面再鋪滿基質(zhì)，共播種20盤，放置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照/黑暗條件為28 ℃/18 ℃，16 h/8 h，培養(yǎng)至二葉一心期。10盤黃瓜幼苗不移栽，繼續(xù)在育苗盤中進(jìn)行生長，另10盤黃瓜幼苗移栽至營養(yǎng)缽中，模擬大田環(huán)境培養(yǎng)。針對移栽處理和不移栽處理，分別于移栽后的1、3、5、7 d 取黃瓜葉片，貯存于-80 ℃?zhèn)溆?。樣品采集方法見?。

1.3 樣品前處理

把黃瓜葉片從-80 ℃冰箱取出后，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速研磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱量50 mg磨碎后的粉末放入2 mL離心管中，加入含千分之一甲酸的40%甲醇混合液，配置成溶質(zhì)溶液比為1∶30的溶液。超聲提取30 min,于4 ℃在12 000 r/min條件下離心30 min,取上清液，用0.22 μm PTFE 濾膜(美國Sigma公司)過濾,取1 mL濾液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。提取液一式3份供上機檢測及后續(xù)分析，為了監(jiān)測儀器分析的穩(wěn)定性和可重復(fù)性,質(zhì)量控制(QC)樣本由所有樣本中各吸取10 μL混合均勻而成。每采集5個樣品后，采集1針QC樣本，隨時監(jiān)測儀器的狀態(tài)。

表1 黃瓜葉片取樣方法

1.4 儀器所用色譜、質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18柱，100 mm×2.1 mm,粒度1.7 μm;流動相A，V(甲酸)∶V(去離子水)=1∶1 000；流動相B，V(甲酸)∶V(乙腈)=1∶1 000；所有試劑均為UPLC級。梯度洗脫，0～1.0 min,2%～5%流動相B，1.0～5.0 min,5%～30%流動相B，5.0～12.0 min,30%～90%流動相B，12.0～13.0 min,90%～100%流動相B,13.0～14.0 min，100%流動相B,14.0～17.0 min，2%流動相B。流速為0.400 mL/min(表2)。柱溫40 ℃。進(jìn)樣量為5 μL。

表2 流動相洗脫梯度

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧(ESI)；離子模式：負(fù)離子；毛細(xì)管電壓2.5 kv；錐孔電壓17 v；電噴霧電壓1.6 kv；掃描時間0.1 s；掃描間隔0.02 s；離子源溫度110 ℃；離子進(jìn)料毛細(xì)管溫度450 ℃；脫溶劑流速800 L/h；錐孔氣流50 L/h；霧化氣、吹脫氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣；離子監(jiān)測質(zhì)荷比(m/z)100～1 200。以質(zhì)荷比為554.261 5的亮氨酸-腦啡肽(LE)[M-H]離子為質(zhì)量鎖定，通過LockSpray系統(tǒng)保證質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

因為質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的格式為應(yīng)用于UNIFY軟件分析的continuum格式，需要首先應(yīng)用Waters Masslynx4.1 software(Waters，USA) 軟件對獲得的原始數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換成centroid格式(cen.raw)。轉(zhuǎn)換成功后用Masslynx4.1 software(Waters，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，包括峰識別、峰過濾、峰對齊等處理工作，優(yōu)化參數(shù)，分析的結(jié)果最終包括保留時間(Retention Time)和質(zhì)荷比(m/z)及峰面積的二維數(shù)據(jù)矩陣。然后應(yīng)用EZinfo軟件對處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，主要包括無監(jiān)督的分析方法——主成分分析(PCA)以及有監(jiān)督的分析方法——經(jīng)過正交去噪后的偏最小二乘法(OPLS-DA),通過設(shè)定過濾條件，模型中變量重要性投影(VIP)>1,P<0.05,找到差異化合物，然后利用UNIFY數(shù)據(jù)庫以及在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異化合物的初步鑒定。數(shù)據(jù)分析所需軟件及應(yīng)用網(wǎng)站如下：Waters Masslynx4.1 software (Waters，USA)；UNIFY software(Waters，USA)；ChemSpider(www.ChemSpider.com)；KEGG(http://www.genome.jp/keg/)；MassBank (http://www.massbank.jp/)；METLIN(http://metlin.scripps.edu/)；MMCD(http://mmcd.nmrfam.wisc.edu/)；PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不移栽與移栽處理黃瓜葉片代謝指紋譜的數(shù)據(jù)獲取

通過UPLC-QTOF-MS系統(tǒng)獲取了不移栽(圖1a)和移栽(圖1b)2種處理7 d后的黃瓜葉片代謝物總離子流圖。從圖1可以得知，不移栽與移栽處理的黃瓜葉片代謝圖譜中的峰和保留時間是相似的，只是在部分保留時間處存在峰高和峰面積上的差別,基于此情況，需對這些峰進(jìn)行匹配，形成一個二維數(shù)據(jù)矩陣以供數(shù)據(jù)分析。

2.2 不移栽與移栽處理黃瓜葉片代謝產(chǎn)物的主成分分析

從圖2可以看出，A與E、B與F、C與G處理聚集在一起，沒有出現(xiàn)明顯分離，但是D與H處理出現(xiàn)了明顯分離，這說明不移栽與移栽處理相比，在7 d出現(xiàn)了差異，也就是說在移栽后7 d出現(xiàn)了緩苗期。對不移栽與移栽處理的1、3、5 d的樣品研究緩苗期形成的關(guān)鍵物質(zhì)意義不大，所以確定以移栽后7 d的樣品為研究對象，進(jìn)行緩苗期形成的差異化代謝物的挖掘。

a.不移栽；b.移栽 a.No-transplanting；b.Transplanting

a、b.不同移載處理的得分圖和載荷圖；A—H同表1a,b.Score plot and loading plot of cucumber leaves under different treatments;A—H as same as Tab.1圖2 不移栽與移栽處理黃瓜葉片PCA分析結(jié)果Fig.2 PCA of cucumber leaves under no-transplantation and transplantation

2.3 不移栽與移栽處理黃瓜葉片代謝產(chǎn)物的OPLS-DA分析

為進(jìn)一步深入研究移栽處理對黃瓜葉片代謝的影響，對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行了二元比較分析。在OPLS-DA數(shù)據(jù)模型中，以離子相對強度作為X軸上的變量，黃瓜葉片各種化合物含量作為Y軸上的變量。為了防止OPLS-DA模型的過度擬合，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了置換檢驗(Permutation test)。經(jīng)過正交去噪后的OPLS-DA能更加清晰地區(qū)分不移栽與移栽2個處理的樣品代謝物質(zhì)差異(圖3a)。首先，采用OPLS-DA模型中的S-plot選擇差異變量，在S-plot圖中離原點越遠(yuǎn)的點表示對2種處理下樣本分類的貢獻(xiàn)越大，即越靠近左下角和右上角的化合物表示對樣本的分類貢獻(xiàn)越大(圖3b)，與PCA中的載荷圖相吻合；其次，根據(jù)模型中變量重要性投影(VIP)，VIP值越大，變量對模型越重要。如果VIP值大于1，則認(rèn)為變量可以很好地對Y進(jìn)行解釋。因此，本研究選取模型中VIP>1的差異變量。最后結(jié)合t檢驗的P值對所篩選的差異變量進(jìn)行驗證，其中P<0.05差異變量被認(rèn)為是移栽前后關(guān)鍵的差異性次級代謝物。根據(jù)以上2個篩選條件VIP>1和P<0.05，共找出6種差異標(biāo)志代謝物。

a、b分別為不同移栽處理的得分圖和S-plot圖

2.4 不移栽與移栽處理黃瓜葉片差異代謝物質(zhì)鑒定

通過對黃瓜葉片樣品進(jìn)行一級質(zhì)譜測定，可以得到各個峰的一級質(zhì)譜信息，進(jìn)而推測出各物質(zhì)的準(zhǔn)分子離子峰(負(fù)離子)(圖4a、b)。在此基礎(chǔ)上，分別以準(zhǔn)分子離子為母離子在相應(yīng)的模式下進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片的測定。基于差異代謝物的質(zhì)荷比、二級質(zhì)譜結(jié)果、UNIFY數(shù)據(jù)庫進(jìn)行初步鑒定，鑒定出的每種化合物包含以下信息：化合物名稱、分子式、精準(zhǔn)分子質(zhì)量、保留時間、響應(yīng)強度、質(zhì)量偏差、理論匹配二級碎片數(shù)量以及加合離子。匹配度較好的化合物可以直接定性，一些不能確定的化合物則需要通過進(jìn)一步的手動工具進(jìn)行鑒定，比如元素組成中的i-Fit值、理論碎片匹配值以及相關(guān)文獻(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫[KEGG(http://www.genome.jp/keg/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、MMCD(http://mmcd.nmrfam.wisc.edu/)、PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)]的信息。結(jié)果顯示，被鑒定出的物質(zhì)有4種，COM1鑒定為戊糖，COM2鑒定為7-O-α-L-鼠李吡喃糖基-山柰酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基，COM3 鑒定為(1-6)-β-D-葡萄糖苷山柰酚-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷，COM4鑒定為商陸苷元，COM5和COM6為未知物質(zhì)(表3)。其中，COM1屬于糖類物質(zhì)，COM2和COM3屬于黃酮類物質(zhì)，COM4為萜類物質(zhì)。

在不移栽處理和移栽處理中，6種差異化代謝物質(zhì)的相對含量變化如圖5所示，其中，移栽處理與不移栽處理相比，COM1、COM2、COM3的相對含量有所升高，COM4、COM5、COM6的相對含量有所降低。也就是說糖類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)有所升高，萜類物質(zhì)有所降低。

a.不移栽；b.移載 a.No-transplanting; b.Transplanting圖4 不移栽和移栽處理黃瓜葉片代謝物質(zhì)與UNIFY數(shù)據(jù)庫的比對鑒定Fig.4 Identification of the metabolites between no-transplantation and transplantation of cucumber leaves using UNIFY database

Number m/z/minRetention timeFormulaResponseintensity/mDaMass errorTheoretical fragments foundAdductsComponent nameCOM1195.050.64C5H10O54 096-0.90+HCOOCOM2755.2054.19C33H40O20106 000118-H7-O-α-L---3-O-β-D-COM3785.2184.29C33H40O1974 1443.316+HCOO(1-6)-β-D--3-O-(2G-α-L-)-COM4605.3327.17C31H46O819 330-0.80+CH3COOCOM5288.9380.54——————COM6304.9170.53——————

圖5 不移栽(D)和移栽(H)處理黃瓜葉片差異化代謝物的相對含量Fig.5 The relative contents of the different metabolites between no-transplantation(D) and transplantation(H) of cucumber leaves

3 結(jié)論與討論

黃瓜作為重要的蔬菜品種，如果緩苗期過長，就會嚴(yán)重影響早發(fā)，降低產(chǎn)量。本試驗研究了移栽對黃瓜秧苗次生代謝物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn),不移栽處理與移栽處理相比，1、3、5 d的樣品都聚集在一起，并沒有明顯的分離，而7 d的樣品出現(xiàn)了顯著的分離，這說明移栽后7 d黃瓜幼苗出現(xiàn)了緩苗期，這與生產(chǎn)上緩苗期的出現(xiàn)時間大致接近[2]。進(jìn)一步通過OPLS-DA二元統(tǒng)計分析，找到了6種不移栽處理與移栽處理相比的差異性標(biāo)記物，這些差異性標(biāo)記物在緩苗期形成過程中起到關(guān)鍵作用。然后，通過UNIFY數(shù)據(jù)庫以及在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異化代謝物質(zhì)鑒定，得到其中4種生物標(biāo)記物，分別為戊糖、7-O-α-L-鼠李吡喃糖基-山柰酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基、(1-6)-β-D-葡萄糖苷山柰酚-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、商陸苷元，種類屬于糖類、黃酮類以及萜類，其余2種尚未得到鑒定。

可溶性糖作為植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物遭遇非生物脅迫時，通過調(diào)節(jié)其含量的變化來適應(yīng)新的環(huán)境。黃酮類化合物的種類有9 000多種[13]，在植物抗性方面有著重要作用，可以增強植物抗病性、抗蟲性，抵御紫外輻射甚至調(diào)控植物體內(nèi)激素的水平[14-16]。在女貞科[17]、黃芩[18]以及玉米[19]中研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類代謝途徑與非生物脅迫有直接聯(lián)系[20]。萜類化合物可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，調(diào)節(jié)植物的耐熱性，抵御光氧化脅迫，直接或間接地參與植物防御等[21]。在本研究中，移栽處理和不移栽處理相比，糖類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)含量有所升高，萜類物質(zhì)含量有所降低，初步確定這些差異化代謝物與移栽后緩苗期的形成密切相關(guān)。

ROUPHAEL等[22]通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)，油麥菜根系中積累的多胺及其偶合物在鋅脅迫響應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在納米銅脅迫下，黃瓜葉片和根系中氨基酸、抗壞血酸、酚類化合物水平顯著上升，檸檬酸水平下降[23]。WANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，鎘、鉛處理的蘿卜體內(nèi)糖類、氨基酸和有機酸水平顯著改變。在鉛脅迫下，玉米根和莖中分別有20種和37種代謝物水平顯著升高，包括多種氨基酸、有機酸和輔酶[25]。TIESSEN等[26]用高效液相色譜法對馬鈴薯塊莖進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，檢測了淀粉合成途徑中的一系列底物、中間物、酶及產(chǎn)物量的變化，再通過對野生株和含有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)基因的馬鈴薯進(jìn)行對比，提出了淀粉合成途徑中一種新的調(diào)節(jié)機制。代謝組學(xué)是進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)分析及調(diào)控的有效手段。

育苗移栽這種生產(chǎn)方式造成的緩苗期對于作物來說也屬于一種非生物脅迫。本試驗結(jié)果顯示，移栽處理與不移栽處理相比，黃瓜葉片中的差異物大部分屬于黃酮類物質(zhì)，這也是黃瓜在受到移栽脅迫時從分子代謝水平上的一種自我調(diào)節(jié)，以此來適應(yīng)移栽后的環(huán)境。應(yīng)用代謝組學(xué)開展更多逆境脅迫下農(nóng)作物應(yīng)答相關(guān)研究，將提高對農(nóng)作物耐受環(huán)境脅迫的分子機制的認(rèn)識，能促進(jìn)對農(nóng)作物脅迫應(yīng)答代謝規(guī)律的了解，有利于從整體水平上把握農(nóng)作物脅迫應(yīng)答機制，從而進(jìn)行作物抗逆性的改良，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，對農(nóng)作物的遺傳多樣性、抗脅迫生理研究有重要的理論研究意義和實際應(yīng)用價值。