劉正，王靜，沈偉，趙舒煊，袁文華，馮曉飛，周海宇

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030；3.解放軍第九四三醫(yī)院特診科，甘肅武威市733000

突觸是神經(jīng)元相互接觸的部位，是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。突觸體最早由Whittaker等[1]命名，是指具有突觸區(qū)完整形態(tài)結(jié)構(gòu)的封閉顆粒，某種意義上可被認(rèn)為是功能完整的活細(xì)胞[2]，但與細(xì)胞又有很大區(qū)別。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中，突觸傳遞最重要的方式是神經(jīng)化學(xué)傳遞。神經(jīng)遞質(zhì)是指神經(jīng)末梢釋放的特殊化學(xué)物質(zhì)，它能作用于支配的神經(jīng)元或效應(yīng)細(xì)胞膜上的受體，從而完成信息傳遞功能[3]。

神經(jīng)遞質(zhì)分為四類，即生物原胺類、氨基酸類、肽類和其他類。生物原胺類神經(jīng)遞質(zhì)是最先發(fā)現(xiàn)的一類，包括多巴胺(dopamine,DA)、腎上腺素(epinephrine,E)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(serotonin,5-HT)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物高香草酸(high vanillic acid,HVA)、3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid,5-HIAA)、左旋多巴(levodopa,L-DOPA)[4]等。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)包括γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)、甘氨酸(glycine,Gly)、 谷氨酸(glutamate,Glu)、組胺(histamine,His)、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)等。這些神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，參與機(jī)體多種生理過程，其含量與人體健康密切相關(guān)[5]。例如，阿爾茨海默病[6]、抑郁癥[7]、帕金森病[8]、尿毒癥[9]、嗜鉻細(xì)胞瘤[10]、白內(nèi)障[11]等都與其中的神經(jīng)遞質(zhì)有密切聯(lián)系。

目前，有多種方法用于測定神經(jīng)遞質(zhì)，如熒光檢測液相色譜法[12]、電化學(xué)分析法、熒光法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]和生物法[14]等，多用于測定和研究大腦部分區(qū)域的神經(jīng)遞質(zhì)。本研究旨在制備大鼠脊髓突觸體，并建立一種測定方法，去檢測大鼠脊髓突觸體中含有哪些神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性Sprague-Dawley大鼠32只，標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供；實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXY(甘)2009-0004；使用許可證號SYXK(甘)2009-0005。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)、Thermo Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜、Allegra 64R超高速離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技公司。SIGMA3-30k離心機(jī)：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。300 kV高分辨率電鏡Tecnai、F30透射電鏡：荷蘭Philips-FEI公司。CentriVap型Labconco離心濃縮系統(tǒng)、超純水儀：英國ELGA公司。BP1215分析天平：德國SATORIUS公司。

1.3 主要試劑與配制

DA、HVA標(biāo)準(zhǔn)品：日本東京化成工業(yè)。NE、5-HT、DOPAC、5-HIAA、GABA、3-甲氧酪胺(3-methoxytyramine,3-MT)、 色 氨 酸 (tryptophan,TRP)、 犬尿氨酸(kynurenine,KYN)、3-羥基犬尿氨酸(3-hydroxy kynurenine,3-HK)、3-羥基-2-氨基苯甲酸(3-hydroxy-2-aminobenzoic acid,3-HAA)標(biāo)準(zhǔn)品：美國密蘇里州SIGMA-ALDRICH公司。E標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大多倫多研究化學(xué)公司。

內(nèi)標(biāo)GABA、甲酸、甲醇、乙腈、丙酮(色譜純)：德國達(dá)姆施塔特默克公司。其他同位素內(nèi)標(biāo)：加拿大TORONTO RESEARCH CHEMCALS公司。丹磺酰氯：日本東京化成工業(yè)。Percoll分層液：美國GE HEALTHCARE公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液的配制：準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)，用甲醇溶液溶解并配置成1 mg/ml的各單標(biāo)儲備溶液；進(jìn)而用甲醇梯度稀釋配置為10 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液200 ng/ml；所有溶液儲存于-20℃冰箱備用；工作標(biāo)準(zhǔn)系列用標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液梯度稀釋而成。10點(diǎn)校正曲線覆蓋線性范圍0.02～20 ng(0.02 ng，0.05 ng，0.1 ng，0.2 ng，0.5 ng，1 ng，2 ng，5 ng，10 ng，20 ng)；質(zhì)控溶液用同樣的方法配置，質(zhì)控濃度為 1 ng(低)，2 ng(中)，5 ng(高)。

1.4 大鼠脊髓突觸體的制備

斷頭處死大鼠后在冰面上取出完整脊髓，將脊髓放入裝有4℃蔗糖緩沖液的燒杯中洗滌，去除雜質(zhì)。從緩沖液中取出脊髓，用濾紙吸干后稱重，剪碎，然后將其放入預(yù)冷的研磨管，按1∶8(W/V)加入4℃蔗糖緩沖液，手動勻漿8次。然后將勻漿液裝入10 ml離心管中，用SIGMA 3k15離心機(jī)4℃、3600 r/min離心15 min。取上清液2 ml均勻緩慢平鋪于3%Percoll梯度層上，用SIGMA 3-30k離心機(jī)4℃、20 000 r/min離心6 min。抽取第三、四層，按1∶5(W/V)加入到4℃蔗糖緩沖液中稀釋，在燒杯中混勻，裝入10 ml離心管，4℃、15 000 r/min離心20 min。取出沉淀，4℃蔗糖緩沖液適當(dāng)稀釋后，裝入1.5 ml EP離心管，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液，即得純化脊髓突觸體(圖1)。大鼠脊髓突觸體制備見圖2。

圖1 Percoll密度梯度離心分層

圖2 大鼠脊髓脊髓突觸體制備簡圖

1.5 透射電鏡觀察

將1.4節(jié)中離心后所得沉淀加入適量(約沉淀的10倍體積)2.5%戊二醛行前固定，4℃過夜，0.1 mol/L磷酸鹽漂洗3次后用1%鋨酸行后固定，再次漂洗后樹脂滲透包埋，常溫下固化1周，修塊，透射電鏡常規(guī)超薄切片，2%醋酸雙氧鈾染色20 min、檸檬酸鉛染色10 min，即可觀察。

1.6 神經(jīng)遞質(zhì)的測定

組織樣本置于1.5 ml EP離心管中；加入萃取液450 μl，水∶甲醇=1∶3(V/V)，加入混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液50 μl；以Tissuelyser儀器進(jìn)行均質(zhì)化。均質(zhì)化條件：不銹鋼珠(直徑3 mm)1粒，振動頻率30 Hz，震動時間3 min，重復(fù)3次；15 000 r/min高速冷凍離心15 min；吸取上清，轉(zhuǎn)移至干凈1.5 ml EP離心管中，真空濃縮至干，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

衍生化反應(yīng)：碳酸氫鈉(pH=11.0，0.2 mol/L)溶液50 μl和丹磺酰氯(2 mg/mL)溶液 50 μl加入揮干的樣品中，渦旋1 min；60℃水浴鍋中反應(yīng)8 min。反應(yīng)溶液18 000 r/min高速冷凍離心10 min，取上清80 μl轉(zhuǎn)移至帶玻璃內(nèi)襯管的進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣5 μl上機(jī)測定。

1.7 色譜條件

ThermoUltimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)；Acquity UPLC?BEH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫35℃；流動相A為乙腈+0.1%甲酸；流動相B為純水+0.1%甲酸；流速為0.25 ml/min；進(jìn)樣量5 μl。梯度條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.8 質(zhì)譜條件

Thermo Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀。離子源：HESI-II，正離子模式。源區(qū)條件：噴霧電壓3 kV，毛細(xì)管溫度350℃，加熱溫度425℃，S-lens RF水平50；鞘氣50，輔助氣13，反吹氣3。所有源區(qū)參數(shù)單位為儀器自設(shè)單位(arbitrary unit)。氮?dú)獗挥米鱄CD碰撞池的碰撞氣和C-trap的阻尼氣；掃描類型為Targeted-MS/MS；分辨率為17 500。儀器控制、數(shù)據(jù)采集和分析均使用Xcalibur 2.2軟件(美國賽默飛世爾科技)。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以()表示，采用t檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)均采用雌性大鼠，故不考慮性別對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。顯著性水平α1=0.05，非常顯著性水平α2=0.01。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓突觸體電鏡圖

大鼠脊髓突觸體是具有完整形態(tài)的橢圓形結(jié)構(gòu)，突觸小泡、線粒體等包含在其中。見圖3。

2.2 神經(jīng)遞質(zhì)的測定

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖4，樣品色譜圖見圖5。

表2 UHPLC-MS/MS質(zhì)譜參數(shù)

圖3 大鼠脊髓突觸體電鏡圖

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5 樣品色譜圖

準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)品，將其定量混合并用標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，得到一系列質(zhì)量濃度不同的溶液，按照1.7，1.8節(jié)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，對上述系列濃度各測定6次后，取其峰面積的平均值，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度X對峰面積Y作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各神經(jīng)遞質(zhì)線性方程、相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 各神經(jīng)遞質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)

3 討論

生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)含量很低，通常在血液中僅為pmol/ml級[15]，且生物樣品本身基體復(fù)雜，內(nèi)源性干擾因素很多，因此神經(jīng)遞質(zhì)的測定異常困難。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菧y定大鼠脊髓突觸體中所含有的神經(jīng)遞質(zhì)，并對其進(jìn)行定性、定量分析。哺乳動物的不同組織，都存在神經(jīng)遞質(zhì)的合成和分泌過程[16]。國內(nèi)外大多數(shù)關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)測定的研究都集中在大腦，鮮有在脊髓。因此我們從脊髓方向?qū)ι窠?jīng)遞質(zhì)進(jìn)行測定研究。

我們需要大鼠脊髓中的突觸體，不是所有脊髓成分，因此我們用不連續(xù)性Percoll密度梯度離心法[17]將大鼠脊髓突觸體提出，用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]對脊髓突觸體進(jìn)行檢測分析。本實(shí)驗(yàn)檢測出大鼠脊髓突觸體中含有DA、NE、5-HT等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，GABA、TRP等氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，以及DA代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA、3-MT，5-HT代謝產(chǎn)物5-HIAA，TRP代謝產(chǎn)物KYN、3-HK、3-HAA。本實(shí)驗(yàn)與其他國內(nèi)外研究者在測定大腦中所含神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)果有很大不同。

表4 大鼠脊髓突觸體中神經(jīng)遞質(zhì)的含量(ng/g)

多數(shù)研究者采用高效液相色譜法[19]測定出大鼠大腦中含有8種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)以及Glu、GABA、Gly、Asp等幾種主要氨基酸。本實(shí)驗(yàn)測定出3-MT、KYN、3-HK、3-HAA，經(jīng)查詢相關(guān)文獻(xiàn)并未在大腦中測出。其中3-MT是DA的代謝產(chǎn)物，KYN、3-HK、3-HAA是TRP的代謝產(chǎn)物。3-MT在多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞體中合成[20]，并儲于紋狀體的含致密中心囊泡的膨體中，在DA神經(jīng)元興奮時可導(dǎo)致其末梢釋放，通過激活獨(dú)特的DA受體，而產(chǎn)生生理效應(yīng)。3-MT在醫(yī)療上用作升壓藥，作用為興奮心臟、增強(qiáng)腎血流量。KYN、3-HK、3-HAA是TRP在犬尿氨酸途徑[21]生成的代謝中間產(chǎn)物，犬尿氨酸途徑與心血管疾病有密切聯(lián)系。用同一種方法，其他研究者在測定大腦中神經(jīng)遞質(zhì)時，只測出其中含有幾種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，或者用同一種方法，只測出其中含有幾種氨基酸。沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道他們在大腦中同時測出含有單胺類和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。我們在大鼠脊髓突觸體中檢測出這兩類神經(jīng)遞質(zhì)。

以上結(jié)果說明大腦和脊髓突觸體中的神經(jīng)遞質(zhì)雖有許多相同之處，但還是有一些細(xì)微的差別；也間接說明脊髓突觸體是具有生理活性的物質(zhì)。它類似于一個功能完整的活細(xì)胞[2]，但與細(xì)胞又有很大區(qū)別，無論是從形態(tài)還是內(nèi)在結(jié)構(gòu)。我們測出脊髓突觸體中所含有的神經(jīng)遞質(zhì)，對于臨床有很大幫助。例如，阿爾茨海默病[22]患者5-HT系統(tǒng)嚴(yán)重受損，5-HT是維持大腦正常智力的重要遞質(zhì)；高血壓[23]患者NE水平發(fā)生改變，導(dǎo)致血管收縮，血壓升高；白內(nèi)障患者3-HK水平改變，可以放大氧化應(yīng)激反應(yīng)，修飾晶狀體蛋白[24]。對這些神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行分析研究，能得出某種神經(jīng)遞質(zhì)與某種疾病之間存在的關(guān)系，這有助于我們對臨床疾病做出正確的診斷以及治療方案。下一步我們將從脊髓突觸體出發(fā)，研究脊髓損傷后如何使患者盡可能向正常生理狀態(tài)恢復(fù)，這是臨床上較難克服的問題。