余維微 曾耀明 鄭偉偉 陳余圣

（浙江省溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

目前，肝性疾病呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類健康。長期大量飲酒易引發(fā)酒精性肝炎。酒精性肝病嚴重危害公共衛(wèi)生，人們越來越重視對肝臟的保護。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的生物類黃酮物質(zhì)，溶解性好且易于吸收。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素具有較強抗氧化性，能夠緩解肝功能障礙，提高機體免疫等功能［1-3］。已有研究報道葡萄籽原花青素能減輕CCl4和酒精引起的小鼠肝損傷［4］，但有關(guān)葡萄籽原花青素改善酒精性肝損傷的作用機制研究還較少。本研究通過建立酒精性肝損傷大鼠模型，研究葡萄籽原花青素對酒精性大鼠肝損傷的影響，并探討其可能的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量160～230 g，購自南京君科生物工程有限公司，合格證號：SCXK（滬）2016-0016。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準。

1.2 試藥與儀器 葡萄籽原花青素購自西安天豐生物科技有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Pr）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。核因子E2相關(guān)因子（Nrf2）、血紅素加氧酶（OH-1）、催化亞基（GCLC）抗體均購自Cell Signaling Technology （Danvers，USA） 公司， 稀釋度1∶100。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）和 Iκ-Bα 抗體購自Santa Cruz公司，稀釋度1∶100。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、BCA蛋白測定試劑盒、電泳上樣緩沖液、PVDF膜、ECL顯色液等Western blotting相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。AU5800全自動生化分析儀購自美國貝克曼公司。

1.3 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組及葡萄籽原花青素低、中、高劑量組。除空白對照組外其他各組大鼠按劑量10 mL/kg灌胃紅星二鍋頭（56%乙醇），連續(xù)灌胃10周，空白對照組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。大鼠造模的同時給藥治療，陽性對照組按200 mg/（kg·d）劑量灌胃聯(lián)苯雙酯；葡萄籽原花青素低、中、高劑量組按100、200、400 mg/（kg·d）劑量灌胃葡萄籽原花青素；空白對照組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。給藥劑量參考文獻［5］和預(yù)實驗確定。各組均常規(guī)飲水和喂食。

1.4 標本采集與檢測 1）末次給藥后禁食不禁水12 h后，眼眶取血，離心（3 000 r/min，15 min）。 取上清液，全自動生化分析儀檢測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）含量。2）大鼠處死后迅速解剖取出肝臟，10%中性甲醛固定，制備石蠟包塊，切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理改變。3）取大鼠肝臟組織，用預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液制成10%肝組織勻漿，采用ELISA法分別根據(jù)試劑盒說明檢測肝組織中MDA、GSH、SOD、GSH-Pr以及 TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 水平。 4）取大鼠肝臟組織，加入裂解液在冰上充分裂解30 min，離心（4 ℃，12 000×g，15 min）。 取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。進行SDS-PAGE，電泳后凝膠蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST清洗后，加入一抗，4℃過夜。TBST清洗后加入二抗，室溫下放置2 h。TBST清洗后ECL顯色，于凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。掃描拍照，用Image pro plus 7.0軟件分析蛋白雜交條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以各蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示其在肝臟組織中的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察 見圖1。空白對照組大鼠肝細胞形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤，以中央靜脈為中心周圍肝細胞索呈放射狀排列。模型組大鼠肝臟出現(xiàn)肝細胞壞死，炎性細胞浸潤，肝細胞索消失。與模型組相比，葡萄籽原花青素各劑量組和陽性對照組大鼠肝臟組織壞死不同程度減輕，炎性細胞浸潤減少。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較 見表1。與空白對照組相比，模型組ALT和GOT水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，葡萄籽原花青素低、中、高劑量組和陽性對照組ALT和GOT水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較（U/L，±s）

表1 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較（U/L，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n ALT GOT空白對照組 12 36.81±5.46 109.54±8.19模型組 12 183.56±12.27△ 217.61±15.23△陽性對照組 12 45.91±6.18* 116.39±8.97*葡萄籽原花青素低劑量組 12 143.82±11.46* 189.15±11.82*葡萄籽原花青素中劑量組 12 96.38±9.52* 169.73±12.51*葡萄籽原花青素高劑量組 12 59.86±7.24* 128.53±9.43*

2.3 各組大鼠肝組織中 MDA、GSH含量與 SOD、GSH-Pr活力比較 見表2。與空白對照組相比，模型組MDA含量顯著升高 （P＜0.05），GSH含量與SOD、GSH-Pr活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，葡萄籽原花青素低劑量組SOD活力顯著升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽性對照組MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH 含量與、GSH-Pr活力顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、GSH含量與SOD、GSH-Pr活力比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織中MDA、GSH含量與SOD、GSH-Pr活力比較（±s）

組 別 n空白對照組 12模型組 12陽性對照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 MDA（nmol/mg）GSH（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH-Pr（U/mg）0.68±0.11 22.61±2.83 795.43±35.16 125.49±15.34 1.59±0.21△ 9.31±1.14△ 235.19±14.29△ 61.28±8.43△0.73±0.14* 17.26±2.51*692.43±30.47*112.85±12.49*1.42±0.20 10.23±1.21 300.49±15.84* 68.01±8.93*1.05±0.17* 14.32±1.95*481.52±22.17* 87.36±10.52*0.76±0.15* 17.32±2.46*658.27±28.43*107.32±12.11*

2.4 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 見表3。與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽性對照組TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素低劑量組 TNF-α、IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和NF-κB水平比較（pg/mg，±s）

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和NF-κB水平比較（pg/mg，±s）

組 別 n空白對照組 12模型組 12陽性對照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 TNF-α IL-1β IL-6 33.92±3.57 21.18±3.86 45.61±5.92 157.39±15.47△ 124.25±13.48△ 138.57±13.72△42.82±3.91* 28.43±4.11* 57.33±6.15*115.48±11.53*102.95±11.37*127.83±11.87 80.47±6.92* 60.46±7.43* 85.41±9.57*48.61±4.38* 33.51±4.67* 56.27±5.98*

2.5 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的比較 見圖2、表4。與空白對照組比較，模型組 Nrf2和 OH-1、GCLC蛋白表達顯著減少，NF-κB p65和 pIκ-Bα 顯增加（P＜0.05）。 與模型組比較，葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽性對照組Nrf2、OH-1和GCLC蛋白表達顯著增加，磷酸化NF-κB p65和Iκ-Bα顯著減少（P＜0.05），葡萄籽原花青素低劑量組磷酸化Nrf-2蛋白顯著增加（P＜0.05）。

圖2 Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達情況

表4 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達灰度值比較（±s）

組 別 n空白對照組 12模型組 12陽性對照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 Nrf-2 OH-1 GCLC 1.26±0.11 0.98±0.08 0.31±0.05 0.44±0.04△ 0.35±0.03△ 0.23±0.02△1.09±0.10*0.93±0.09*0.28±0.03*0.54±0.04*0.36±0.04 0.21±0.03 0.87±0.06*0.45±0.04*0.26±0.02*0.98±0.10*0.92±0.08*0.31±0.06*NF-κB p65 pIκ-Bα 0.34±0.05 0.35±0.07 0.95±0.07△ 0.94±0.08△0.43±0.04*0.44±0.05*0.91±0.06 0.89±0.07 0.82±0.08*0.79±0.09*0.67±0.06*0.64±0.05*

3 討 論

酒精性肝病在我國的發(fā)病率呈增長趨勢，可通過保肝護肝食品或者保健品來滋養(yǎng)防范。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提煉出來的具有抗氧化等活性的物質(zhì)，而葡萄籽是生產(chǎn)葡萄汁和葡萄酒的廢棄部分，因此，對于開發(fā)保肝護肝藥物具有良好的發(fā)展前景。

機體在大量攝入乙醇后，經(jīng)乙醇脫氫酶催化脫氫被氧化，三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙以及脂肪酸氧化減弱從而影響脂肪代謝，乙醇還能激活氧分子產(chǎn)生氧自由基引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽耗竭。ALT和GOT是反映肝功能的重要生化指標，肝臟組織受到損傷時，組織和血清中ALT和GOT水平會升高［6］。本實驗連續(xù)兩周給大鼠灌胃紅星二鍋頭后，模型組大鼠肝細胞壞死，炎性細胞浸潤，肝細胞索消失，ALT和GOT含量升高，說明大鼠灌胃乙醇后肝組織損傷，肝功能降低，酒精性肝損傷大鼠模型建立成功。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，其含量變化間接反映氧自由基含量的變化，在一定程度上反映細胞損傷程度［7］。SOD和GSH均是體內(nèi)重要的自由基清除劑，GSH-Pr是重要的抗氧化酶，可介導(dǎo)GSH清除H2O2和脂質(zhì)過氧化物［8］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素作用后，與模型組相比，不同濃度的葡萄籽原花青素可降低大鼠肝臟組織MDA含量，提高GSH水平與SOD、GSH-Pr活力，說明葡萄籽原花青素能改善大鼠酒精性肝損傷，表現(xiàn)出肝保護作用，原因可能是葡萄籽原花青素具有較強抗氧化活性和清除自由基的作用。

Nrf2是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)氧化還原平衡過程中發(fā)揮重要作用，自由基或親核物質(zhì)刺激時發(fā)生磷酸化，Nrf2和細胞骨架相關(guān)蛋白發(fā)生解離，Nrf2進入細胞核啟動Nrf2下游靶基因血紅素氧合酶1（OH-1）、GCLC等抗氧化酶的表達而發(fā)揮抗氧化功能［9-10］。研究表明，大量酒精作用能抑制Nrf2的正常活化表達，導(dǎo)致酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加重［11］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素能提高酒精性肝損傷大鼠Nrf2和OH-1蛋白表達，其可能通過上調(diào)Nrf2/OH-1信號通路，激活了下游抗氧化酶的表達，從而減輕了酒精對大鼠肝臟造成的損傷。酒精引起的氧化損傷還可以繼發(fā)性激活肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致釋放大量細胞因子和炎癥介質(zhì)［12］。NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，當細胞被激活后，NF-κB p65 與抑制因子 Iκ-Bα 快速磷酸化為 pIκ-Bα，復(fù)合物被水解，胞漿內(nèi)的NF-κB p65移位進入細胞核，發(fā)揮基因調(diào)控作用，促進下游TNF-α、IL-1β和IL-6等大量炎性細胞因子分泌，在炎癥反應(yīng)的細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［13-15］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素高劑量組NF-κB p65和pIκ-Bα較模型組顯著減少，說明葡萄籽原花青素可抑制Iκ-Bα磷酸化，也可能通過NF-κB通路保護肝組織損傷。其下游炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平變化與NF-κB p65和pIκ-Bα蛋白變化一致，進一步說明葡萄籽原花青素可能通過抑制NF-κB信號通路的激活從而保護肝組織損傷。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能激活Nrf2/OH-1信號通路，促進下游抗氧化酶的表達，同時抑制了酒精性肝損傷大鼠NF-κB信號通路的激活，從而減輕了酒精引起的肝損傷大鼠的損傷。