鄒 偉 劉 鵬 于學(xué)平 戴曉紅 于婷婷

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

腦出血是指腦實(shí)質(zhì)發(fā)生的非外傷性的出血性病變，具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)。我國(guó)是腦出血髙發(fā)國(guó)家之一，嚴(yán)重影響人們的生命健康和生活質(zhì)量［1］。腦出血后線粒體功能障礙會(huì)引起繼發(fā)性腦損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［2］。自噬也參與腦出血后的病理生理過(guò)程［3］，而線粒體自噬是一種靶向自噬，可以選擇性去除受損線粒體，減少腦的繼發(fā)性損傷。Beclin1作為自噬相關(guān)基因ATG6的哺乳動(dòng)物同源體，主要參與自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，可以誘導(dǎo)自噬發(fā)生和自噬泡形成［4］，它與LC3-B一樣均可作為自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白，Beclin1的表達(dá)水平能更好地反映自噬激活情況。BNIP3L參與介導(dǎo)線粒體自噬，在消除功能失調(diào)或過(guò)多的線粒體中扮演了重要的角色。目前頭穴透刺法已成為中醫(yī)治療急性腦出血的重要治療手段［5-6］，它是通過(guò)刺激腦不同的神經(jīng)功能分區(qū)的方式，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［7］。本研究應(yīng)用自體血注射方法制備急性期腦出血模型，觀察Beclin1和BNIP3L的表達(dá)情況，闡述頭穴透刺法有可能通過(guò)影響急性期腦出血后的自噬水平而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇90只SD雄性大鼠，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，其動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（黑）2017-015，大鼠體質(zhì)量 280～310 g。 飼養(yǎng)維持自然晝夜節(jié)律，自由飲食，室溫控制在（25±3）℃，空氣濕度為55%～60%。

1.2 試劑與儀器 腦立體定位（型號(hào)STW-3X，購(gòu)于中國(guó)成都儀器廠），臺(tái)式牙鉆機(jī)（型號(hào)307-6，購(gòu)于中國(guó)上海齒科醫(yī)械廠），石蠟包埋機(jī)（型號(hào)EG1150H，購(gòu)于德國(guó)萊卡公司），石蠟切片機(jī)（型號(hào)RM2235，購(gòu)于德國(guó)萊卡公司），兔抗Beclin1抗體（型號(hào)bs-1353R，購(gòu)于中國(guó)博奧森公司），兔抗BNIP3L抗體（型號(hào)12396，購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司），二抗山羊抗兔IgG（型號(hào) ab7090，購(gòu)于英國(guó) Abcam 公司），3-MA（型號(hào)189490，購(gòu)于美國(guó)CALBIOCHEM公司），免疫組化檢測(cè)試劑盒（型號(hào)PV-6001，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司），DBA顯色增強(qiáng)劑（型號(hào)ZLI-9034Z，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司），PBS緩沖液 （型號(hào)AR0030，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司），顯微攝影系統(tǒng)（型號(hào)BX43，購(gòu)于日本OLYMPUS公司）。

1.3 分組與造模 大鼠隨機(jī)分為5組（假手術(shù)、模型組、3-MA組、針刺組、針刺組+3-MA組），再分為6 h、1 d和7 d等3個(gè)時(shí)間亞組，每亞組6只。腦出血模型采取自體血注射的方法［8］。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉、剃毛、消毒后將其固定于腦立體定位上，正中切長(zhǎng)約1 cm口，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點(diǎn)右旁開(kāi)3.5 mm，后0.2 mm定點(diǎn)，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔［9］，距尾端3 cm處剪斷鼠尾取血50 μL，將微量注射器固定于立體定位儀上進(jìn)針約6 mm后，將血液50 μL以25 μL/min速度推進(jìn)尾殼核，留針約2 min后出針。術(shù)后封閉、縫合、消毒。造模6 h后，采用Longa評(píng)分法［10］對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分＞0者判定為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征，且處死后取腦證實(shí)顱內(nèi)血腫者視為造模成功。

1.4 干預(yù)方法 假手術(shù)組操作步驟如上，但不注血；模型組操作步驟如上；針刺組參照 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》選取百會(huì)穴和曲鬢穴，以0.35 mm×40 mm針灸針快速刺入百會(huì)穴帽狀腱膜下，并向曲鬢穴透刺，進(jìn)針深度大約1.5 cm。以150～180 r/min的速度進(jìn)行捻轉(zhuǎn)，每日1次，每次留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)刺激2次，每次持續(xù)5 min，每24小時(shí)進(jìn)行1次，針刺操作均由同一針灸臨床醫(yī)師進(jìn)行；3-MA組：在造模前30 min將自噬抑制劑3-MA［11］注射入側(cè)腦室；針刺+3-MA組：在 3-MA組的基礎(chǔ)上，采用同樣的針刺方法。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）神經(jīng)功能評(píng)分。采用Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分［12］對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能測(cè)定。輕抓大鼠尾端，抬起高于桌面至20 cm，觀察大鼠四肢活動(dòng)情況。2）免疫組化。大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)估后，使用10%水合氯醛過(guò)量麻醉，以注血點(diǎn)為中心前后各旁開(kāi)3 mm處冠狀切開(kāi)，將切下的6 mm厚度的大鼠腦組織塊，石蠟包埋，切片機(jī)切成厚度4 μm的組織片后脫蠟至水。室溫下在3%H2O2中孵育，PBS沖洗，切片入枸櫞酸鹽緩沖液。用PBS沖洗5 min，滴加一抗，過(guò)夜。滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗。DAB顯色5～10 min。蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染1 min，水洗，脫水至二甲苯，中性樹(shù)膠封片，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)情況進(jìn)行分析并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件。神經(jīng)功能評(píng)分和免疫組化結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析結(jié)合Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分比較 見(jiàn)表1。造模前各組無(wú)神經(jīng)功能缺損，各項(xiàng)評(píng)分均為0，造模后1 d組大鼠神經(jīng)功能缺損最重，7 d時(shí)神經(jīng)功能缺損體征明顯緩解。7 d時(shí)針刺組均較其他各組神經(jīng)功能改善明顯（P＜0.05）。

表1 各組Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組Bederson神經(jīng)功能缺損體征評(píng)分比較（分，±s）

與 3-MA 組比較，*P＜0.05；與針刺組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 7 d假手術(shù)組 6 0.00±0.00模型組 6 1.45±0.21 3-MA 組 6 1.63±0.15△6 h 1 d 0.00±0.00 0.00±0.00 2.28±0.21 2.52±0.19 2.53±0.34△ 2.83±0.21△針刺組 6 0.86±0.08*2.33±0.22 2.59±0.13針刺+3-MA 組 6 2.48±0.26 2.75±0.25 1.56±0.23

2.2 各組Beclin1和BINP3L在腦組織陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較 見(jiàn)表2～表3，圖1～圖2。3-MA組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)最少，針刺組表達(dá)最多（P＜0.05），針刺組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），針刺組與針刺+3-MA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

腦出血后的病理?yè)p害主要包括物理?yè)p傷和血腫引起的腦原發(fā)性損傷［13］及由線粒體功能障礙、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥介質(zhì)的釋放等所誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷。繼發(fā)性腦損害與腦出血后神經(jīng)功能惡化和預(yù)后密切相關(guān)［2］。自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。但是，自噬在腦損傷后起到有益還是有害的作用仍存在爭(zhēng)議。線粒體自噬出現(xiàn)在蛛網(wǎng)膜下腔出血中，并起到保護(hù)神經(jīng)組織免于蛛網(wǎng)膜下腔出血早期的凋亡、壞死性損傷［14］的作用。線粒體自噬是現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞器選擇性自噬研究中認(rèn)識(shí)最清楚的一種。線粒體可以為細(xì)胞提供能量、參與細(xì)胞的凋亡，因此細(xì)胞對(duì)損傷線粒體的清除至關(guān)重要，而損傷線粒體的清除依賴(lài)于線粒體自噬。

表2 各組腦組織Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較（±s）

表2 各組腦組織Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較（±s）

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表3 各組腦組織BINP3L陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較（±s）

表3 各組腦組織BINP3L陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果比較（±s）

組 別 n 7 d假手術(shù)組 6 24.83±1.47模型組 6 51.67±1.27*3-MA 組 6 19.50±3.53 6 h 1 d 16.33±0.72 17.00±0.63 26.33±1.73*33.17±0.75*7.17±0.95 9.67±1.21△針刺組 6 52.67±1.24 33.00±0.89 43.50±0.84針刺+3-MA 組 6 22.33±0.52△ 28.50±0.55 35.83±0.96△

圖1 7 d時(shí)各組大鼠腦組織Beclin1蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，400倍）

圖2 7 d時(shí)各組大鼠腦組織BNIP3L蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，400倍）

Beclin1主要參與自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，其活性受PI3K的影響［13］，PI3K的催化亞基Vps34與Beclin1的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致磷脂酞肌醇磷酸化為磷脂酞肌醇-3-磷酸（PI3P），進(jìn)一步促進(jìn)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的合成，同時(shí)Beclin1還可與UVRAG基因和Bcl-2共同形成復(fù)合物來(lái)共同調(diào)控自噬過(guò)程［14］。BNIP3L是介導(dǎo)線粒體自噬的重要途徑之一。期初研究者把BNIP3L作為BH3-only蛋白研究其凋亡方面的作用，但發(fā)現(xiàn)其凋亡能力較弱［15］。Mclelland等的研究發(fā)現(xiàn)線粒體的程序性清除需要BNIP3L［16］。Novak的研究表明，BNIP3L有2個(gè)LIR序列，它可以通過(guò)LIR與LC3A等Atg8蛋白家族成員相互作用，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體自噬。對(duì)BNIP3L同源蛋白BINP3的研究發(fā)現(xiàn)，其17與24位的色氨酸殘基的磷酸化可促進(jìn)其與LC3B的相互作用［17］。Maiuri等的研究發(fā)現(xiàn)BH3-only蛋白可以與Beclin1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bcl-2，從而釋放出游離的Beclin1，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬發(fā)生［18］。因此作為BH3-only蛋白的BNIP3L也可能通過(guò)這一機(jī)制誘導(dǎo)自噬。

《難經(jīng)·四十七難》云“人頭者，諸陽(yáng)之會(huì)也”，因而針刺頭部腧穴具有調(diào)節(jié)陰陽(yáng)、疏通一身氣血的作用，而“百會(huì)”透刺“曲鬢”可以貫穿督脈、足太陽(yáng)膀胱經(jīng)和足少陽(yáng)膽經(jīng)，可以達(dá)到一針橫貫額、頂、顳三區(qū)的效果［19］。從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，頭針治療急性腦出血療效引起關(guān)注，頭穴透刺法是頭針的重要組成部分。我們的研究團(tuán)隊(duì)在前期臨床研究中證實(shí)，頭穴透刺能明顯降低急性腦出血患者神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，總有效率達(dá)91.67%［20］。其他研究者通過(guò)在臨床隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，頭針利于腦出血患者的血腫吸收和改善臨床神經(jīng)功能缺損評(píng)分［21］。本次實(shí)驗(yàn)在自體血注入的急性腦出血模型基礎(chǔ)上，采用神經(jīng)功能評(píng)分法觀察頭穴透刺在腦出血急性期改善神經(jīng)功能情況和免疫組化法對(duì)Beclin1和BNIP3L進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示假手術(shù)組，二者表達(dá)量均始終處于低水平表達(dá)狀態(tài)，且各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量并無(wú)顯著差異，而其他各組蛋白表達(dá)水平隨腦出血時(shí)間而升高，至7 d時(shí)最高，相同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，針刺組表達(dá)量最高，而3-MA組最低，3-MA+針刺組的表達(dá)水平則處于模型組和3-MA組之間。由此可見(jiàn)，頭穴透刺法的刺激可以促使Beclin1和BNIP3L的表達(dá)量升高，使其對(duì)自噬體膜結(jié)構(gòu)形成的催化作用增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。3-MA抑制劑的使用則可以直接抑制PI3K活性，而阻礙自噬體的形成。Beclin1相對(duì)表達(dá)水平的降低則驗(yàn)證了3-MA對(duì)自噬的抑制作用，在針刺效應(yīng)和3-MA抑制劑的聯(lián)合作用下，蛋白的表達(dá)量仍高于單獨(dú)3-MA抑制劑組，進(jìn)一步證實(shí)了頭穴透刺法可以通過(guò)對(duì)自噬的誘導(dǎo)來(lái)緩解3-MA對(duì)自噬的抑制作用，對(duì)腦出血大鼠腦組織細(xì)胞的具有保護(hù)作用，并且該結(jié)果與神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果相一致。所以，頭穴透刺法可以改善急性期腦出血大鼠的神經(jīng)功能可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin1和BNIP3L的表達(dá)有關(guān)。