馬紫童 唐秀鳳 高瑩瑩 李曉曦 陳宇恒 于 萍 劉仁慧

（首都醫(yī)科大學(xué)，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京100069）

支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)最常見的慢性呼吸道疾病，是一種以嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞浸潤為主的慢性氣道變態(tài)反應(yīng)性疾病，可伴有氣流受限、氣道高反應(yīng)性、氣道黏液腺肥大和氣道重塑等［1-2］。近年來，哮喘的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，如何干預(yù)哮喘發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為廣大學(xué)者的研究重點［3-4］?；跉獾姥装Y及氣道重塑是哮喘的重要病理改變的認(rèn)識，抗炎及改善氣道重塑是防治哮喘的重要治療策略［5］。因具有強大的抗炎作用，糖皮質(zhì)激素（GC）是目前治療哮喘的首選藥物，但對氣道重塑的改變并不理想。大量研究表明，在哮喘氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿女貞子煎劑或其有效組分可以協(xié)同GC改善哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的病理改變［7-8］，并能提高氣道淋巴細胞的凋亡率，上調(diào)哮喘大鼠肺組織P53蛋白量，下調(diào)Bcl-2蛋白量。本研究以哮喘支氣管肺組織的凋亡水平，及凋亡相關(guān)因子Caspase-9、Fas、Hras、NF-κB、Xiap mRNA表達為主要觀察指標(biāo)，進一步觀察淫羊藿女貞子配伍協(xié)同糖皮質(zhì)激素對哮喘氣道細胞凋亡的影響作用并探討其作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（120±10）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 試藥與儀器 卵蛋白（OVA，美國Sigma公司，貨號A5253-100 g）；氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司，貨號A8222-250 mL）；淫羊藿、女貞子水提物（西安康威生物有限公司）；淫羊藿有效成分提取物（有效成分總黃酮類，含總黃酮以淫羊藿苷計為80%，提取率2.5%，上海一林生物科技有限公司）；女貞子有效成分提取物（總環(huán)烯醚萜+總黃酮類，含量分別以齊墩果酸和蘆丁計，總含量＞80%，提取率5%，上海一林生物科技有限公司）；吸入用布地奈德混懸液（Bun，每支1 mg/2 mL，AstraZeneca Pty Ltd，貨號 17311）；一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光，碧云天生物技術(shù)研究所，貨號C1088）；免疫染色洗滌液（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號 P0106）；蛋白酶 K（Proteinase K，碧云天生物技術(shù)研究所，貨號 ST533）；6×Loading Buffer（北京索萊寶科技有限公司）；RNase-free H2O［天根生化科技（北京）有限公司］；FastQuant RT Super Mix［天根生化科技（北京）有限公司］；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版［SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司］。402A超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；霧化箱 （規(guī)格40 cm×30 cm×20 cm，以有機玻璃為材料自制）；分光光度計（北京博奧，型號NanoQTM）；熒光定量 PCR 儀（ABI，型號 7900HT）；尼康（Nikon）ECLIPSE 80i生物顯微鏡及NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件（北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司）。

1.3 分組與造模 取雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（120±10） g，42 只，隨機分為 7 組，每組 6 只，即正常對照組（對照組）、哮喘模型組（模型組）、布地奈德組、淫羊藿女貞子煎劑組（煎劑組）、布地奈德合煎劑組（合煎劑組）、淫羊藿女貞子提取物組（提取物組）、布地奈德合提取物組（合提取物組）。卵蛋白致敏及激發(fā)復(fù)制大鼠哮喘模型。

1.4 給藥方法 造模成功后，實驗第36天開始給藥，共計4周。具體給藥方法見表1。

表1 給藥方法

1.5 標(biāo)本采集與檢測 實驗第65天，腹腔麻醉，迅速開胸，取出肺組織連同氣管，冰浴。結(jié)扎左主支氣管，剪下左肺，適當(dāng)剪取部分左肺，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。左肺其余部分-80℃冰箱保存。1）肺組織細胞凋亡水平。采用TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡水平，按照試劑盒說明書進行操作：首先將肺組織石蠟切片脫蠟，滴加 50 μL 蛋白酶 K（20 μg/mL），30 ℃作用25 min，PBS洗滌3次。滴加50 μL的TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。2）肺組織Caspase-9、Fas、Hras、NF-κB、Xiap mRNA 表達。 Trizol法抽提肺組織總RNA，用分光光度計檢測RNA的濃度，應(yīng)用引物和M-MLVRT反轉(zhuǎn)錄酶在42℃15 min，95℃ 3 min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBR Green）進行擴增，設(shè)立18S為內(nèi)對照。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入20 μL的PCR反應(yīng)體系中， 反應(yīng)條件為95℃ 15 min，95℃ 10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCT相對定量法加以分析，以Nc組作為對照樣本。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0 for Windows統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果選擇LSD（方差齊）或 Tamhane′s T2（方差不齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織細胞凋亡水平比較 見表3和圖1。與對照組比較，模型組細胞凋亡水平的陽性面積和積分光密度值均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，煎劑組、合煎劑組、提取物組、合提取物組可上調(diào)細胞凋亡水平（P＜0.05或P＜0.01）。合煎劑組大鼠細胞凋亡水平較布地奈德組、煎劑組顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；合提取物組大鼠肺組織的細胞凋亡水平較布地奈德組、提取物組亦顯著上調(diào) （P＜0.05或P＜0.01）。提示激素給藥的同時合用淫羊藿女貞子煎劑或提取物，均可協(xié)同上調(diào)大鼠肺組織細胞凋亡水平。

表3 各組大鼠肺組織細胞凋亡水平比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織細胞凋亡水平比較（±s）

與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與布地奈德組比較， ■P＜0.05， ■■P＜0.01； 與煎劑組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與提取物組比較，▲▲P＜0.01。 下同

組 別 n 陽性面積 積分光密度對照組 6 107.79±9.04 422.67±55.85模型組 6 46.26±1.87** 180.96±11.98**布地奈德組 6 59.32±7.92 203.61±39.87煎劑組 6 69.08±3.24△△ 286.96±36.24△△■■合煎劑組 6 91.42±10.14△△■■○ 367.46±37.53△△■■○○▲▲提取物組 6 70.08±9.51△ 277.45±54.44△△■■合提取物組 6 92.42±11.27△△■■ 373.23±59.39△△■■○○▲▲

圖1 各組大鼠細胞凋亡熒光圖（200倍）

2.2 各組大鼠肺組織Caspase-9和Xiap mRNA表達的比較 見表4。與對照組相比，模型組大鼠肺組織Caspase-9 mRNA表達顯著降低 （P＜0.01），但Xiap mRNA顯著升高（均P＜0.01）。與模型組比較，除布地奈德組外其余4個給藥組對Xiap mRMA有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05或P＜0.01）；煎劑組、合煎劑組、合提取物組Caspase-9表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與布地奈德組比較，合煎劑組、合提取物組Caspase-9 mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組肺組織Caspase-9、Xiap mRNA表達比較（±s）

表4 各組肺組織Caspase-9、Xiap mRNA表達比較（±s）

組 別 n Caspase-9 mRNA Xiap mRNA對照組 6 1.59±0.14 1.03±0.14模型組 6 1.03±0.13** 1.81±0.20**布地奈德組 6 1.26±0.12 1.36±0.18煎劑組 6 1.46±0.17△ 1.22±0.18△合煎劑組 6 1.70±0.07△△■ 1.11±0.08△△提取物組 6 1.26±0.16 1.30±0.14△合提取物組 6 1.83±0.18△△■■ 1.18±0.18△△

2.3 各組大鼠肺組織Fas、Hras、NF-κB mRNA表達的比較 見表5。與對照組比較，模型組大鼠肺組織NF-κB mRNA 顯著升高 （P＜0.01），F(xiàn)as及 Hras mRNA 無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.01）。與模型組比較，5個給藥組對NF-κB mRNA 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；煎劑組、合煎劑組、合提取物組Fas mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；各給藥組對 Hras mRNA均無顯著影響。與布地奈德組比較，合煎劑組Fas、Hras mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），合提取物組Hras mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表5 各組大鼠肺組織 Fas、Hras、NF-κB mRNA 表達比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織 Fas、Hras、NF-κB mRNA 表達比較（±s）

組 別 n Fas mRNA對照組 6 1.24±0.27模型組 6 1.40±0.24布地奈德組 6 1.93±0.18煎劑組 6 2.40±0.34△合煎劑組 6 2.88±0.39△△■提取物組 6 2.18±0.28合提取物組 6 2.61±0.30△△Hras mRNA NF-κB mRNA 0.56±0.25 1.36±0.11 2.27±0.32 3.58±0.29**1.55±0.26 1.52±0.15△△0.97±0.29■■ 2.28±0.40△△2.55±0.30■ 1.88±0.39△△2.92±0.26■■ 1.80±0.20△△2.70±0.26■■ 1.42±0.27△△

3 討 論

哮喘的標(biāo)志性病理特征是氣道炎癥和氣道重塑［9］，主要表現(xiàn)為氣道嗜酸性粒細胞炎癥，上皮下網(wǎng)狀基底膜厚度增加，氣道平滑肌質(zhì)量增加，血管生成和杯狀細胞增生等。故抗炎，改善或逆轉(zhuǎn)氣道重塑是治療哮喘的重要方法。細胞凋亡（apoptosis），又稱程序性細胞死亡，是在一定的生理或病理條件下，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的細胞自主性、有序性的死亡過程［10］。研究表明［11］，細胞凋亡的異常是哮喘重要的發(fā)病機制之一。哮喘模型中炎性細胞如嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等，及血管、支氣管平滑肌細胞凋亡出現(xiàn)凋亡水平異常降低，而上皮細胞凋亡水平異常升高。這導(dǎo)致氣道狹窄、炎性因子和趨化因子分泌增多，進一步加重氣道高反應(yīng)性、炎性細胞浸潤、黏液過多分泌、氣道的病理性損傷等［12］。

目前細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括外源性途徑、內(nèi)源性途徑（又稱線粒體凋亡途徑）及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，3條通路相互密切關(guān)聯(lián)，在多種凋亡因子參與下，形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，對凋亡進行精細地調(diào)控［13］。內(nèi)源性途徑的凋亡通路是由線粒體介導(dǎo)的細胞色素C的釋放和Caspases激活的生物化學(xué)通路。已有研究表明，在哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中，線粒體的功能及其結(jié)構(gòu)被破壞，影響大量細胞功能，如離子調(diào)節(jié)（特別是 Ca2+）、增殖和凋亡等［14］。 Caspase-9 是凋亡信號的啟動者，可與上游死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子結(jié)合，形成二聚體，通過自身催化而激活，進而誘導(dǎo)凋亡。Caspases酶的抑制因子IAPs（inhibitors of apoptosis proteins）蛋白家族是一類具有抗凋亡活性的蛋白質(zhì)，可通過抑制Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程中相關(guān)蛋白酶的活性而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。Xiap是IAPs蛋白家族中的一員，可抑制Caspases，參與NF-κB調(diào)節(jié)等發(fā)揮凋亡抑制作用。NF-κB是參與哮喘氣道炎癥及重塑的重要因子，NF-κB可通過調(diào)控參與免疫反應(yīng)早期和炎癥反應(yīng)各階段的許多因子，包括：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、趨化因子、黏附分子等，調(diào)控細胞凋亡因子如腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-1（TRAF-1），抗細胞凋亡的蛋白-1 和-2（IAP1/IAP2）等，從而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用［15-16］。綜上，Caspase-9和Xiap是調(diào)控內(nèi)源性途徑細胞凋亡的重要基因，且主要與蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)。外源性途徑的凋亡通路是由死亡受體介導(dǎo)，通過各種信號轉(zhuǎn)到系統(tǒng)傳遞凋亡信號，誘導(dǎo)細胞凋亡。Fas-FasL途徑屬于外源性途徑。Fas是一種跨膜蛋白，通過與FasL結(jié)合可以啟動凋亡信號的傳導(dǎo)從而促進細胞凋亡。HRas為Harvery鼠肉瘤病毒ras基因的人類同源基因，編碼產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量2.1萬的蛋白質(zhì)，稱為p21蛋白，與細胞生長有關(guān)。HRas可通過Ras-Raf-MEK-ERK途徑抑制細胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，淫羊藿女貞子合用激素布地奈德可協(xié)同上調(diào)哮喘大鼠肺組織的細胞凋亡水平。qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠凋亡促進基因Caspase-9 mRNA表達下調(diào)，凋亡抑制基因Xiap、NF-κB mRNA表達上調(diào)，F(xiàn)as及Hras mRNA表達無顯著性差異。結(jié)果提示哮喘大鼠肺組織細胞凋亡水平下調(diào)主要受內(nèi)源性途徑的凋亡通路調(diào)控。與模型組比較，中藥單用或合用激素可上調(diào)Caspase-9、Xiap、Fas mRNA表達，下調(diào)NF-κB mRNA表達。與激素組比較，合用組Caspase-9 mRNA表達有顯著差異。結(jié)果提示淫羊藿女貞子配伍合用激素上調(diào)哮喘大鼠肺組織細胞凋亡水平可能與調(diào)控 Caspase-9 、Xiap、Fas、NF-κB mRNA 表達有關(guān)。其中中藥與激素合用上調(diào)Caspase-9 mRNA表達的作用強于激素單用。上述研究結(jié)果提示調(diào)節(jié)Caspase-9、Xiap、Fas、NF-κB mRNA 的表達是淫羊藿女貞子合用激素治療哮喘的作用機制之一，且主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性途徑的細胞凋亡，上調(diào)肺組織的凋亡水平，從而改善哮喘的氣道炎癥及氣道重塑的病理改變。