畢懿康 黃默冉 周路 吳琪 時(shí)瀟 耿彩云 李紅艷 王海妹 張藝

亓建洪 秦暉

骨缺損是骨科常見的較難處理疾患之一,近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，采用特定細(xì)胞結(jié)合組織支架修復(fù)骨缺損成為可能。干細(xì)胞具有良好的增殖能力和多向分化能力，可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程中[1]。相比于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)具有資源豐富，采集時(shí)無損傷，免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，已成為新型種子細(xì)胞而廣泛用于組織工程領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中[1-3]。

植入組織工程支架不可避免地存在感染風(fēng)險(xiǎn)，將抗生素裝載于支架是常用的預(yù)防感染方法。但是，特定抗生素的抗菌范圍有限且存在耐藥可能，限制了其使用[4]。銀是強(qiáng)效廣譜抗菌劑，可以殺滅革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、真菌、某些病毒及一些耐藥細(xì)菌，且病原微生物不會對銀產(chǎn)生抵抗[5-8]。納米銀通過改變銀的比表面積，可進(jìn)一步擴(kuò)大其抗菌能力。目前，納米銀已是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的納米材料。有研究將納米銀作為抗菌劑加載于組織工程支架預(yù)防感染，結(jié)果顯示，納米銀可預(yù)防感染并具有良好的生物相容性[9]。已有一些研究將納米銀作為抗菌材料加載于多種組織工程支架[4, 10-11]，但有關(guān)納米銀對hUCMSC的作用，如毒性反應(yīng)、對成骨分化的影響及其機(jī)制等，尚缺乏較為詳盡的研究。

本研究擬通過探究納米銀對hUCMSC的作用及其相關(guān)機(jī)制，為采用加載納米銀及hUCMSC的組織工程支架修復(fù)骨缺損提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑：納米銀水溶液(納米銀直徑約20 nm，質(zhì)量濃度2 g/L)購自滬正納米科技有限公司，硝酸銀購于美國Sigma Aldrich公司；α-基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α-MEM)、胎牛血清(FBS)、1% 青霉素-鏈霉素雙抗、0.25% 胰蛋白酶/EDTA及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；抗CD44、抗CD90小鼠單克隆抗體及羊抗鼠抗體均購自英國Abcam公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物公司；瓊脂糖微珠購自美國Billerica公司；BCA蛋白測定試劑盒購自美國Rockford公司；茜素紅染液和羅丹明-鬼筆環(huán)肽染液購自美國Sigma公司；DAPI染液、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司； PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒均購自日本Takara公司

主要設(shè)備：透射電鏡(日本Tokyo公司)、酶標(biāo)儀(BIO-TEK ELX- 800，美國寶特公司)、倒置顯微鏡(DFC420C，德國萊卡公司)。

本研究經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(批件編號：201758)，人臍帶由泰山醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

1.2 納米銀的準(zhǔn)備和觀察

根據(jù)Liu等[12]報(bào)道的方法提純納米銀，簡述如下：購買的納米銀溶液以21 000×g離心15 min，去除上清液后加入3 mL鈍化劑(1% 1，2，3—苯并三唑)，再以9 500×g離心20 min；所得納米銀用丙酮、100%酒精清洗，于真空干燥箱中45 ℃干燥24 h。干燥后的納米銀用無菌去離子水在超聲條件下配制成質(zhì)量濃度2 g/L的儲存液，4 ℃避光保存。硝酸銀溶液以同樣方法配制。

取1滴配制好的納米銀溶液(質(zhì)量濃度2 g/L)滴于銅網(wǎng)表面，干燥后以透射電鏡觀察納米銀的形態(tài)和大小。

1.3 hUCMSC的分離及鑒定

取人臍帶于無菌條件下剔除血管及被膜，分離得到沃頓膠，清洗后剪碎，置于15 mL離心管中，加入Ⅱ型膠原酶消化，37 ℃水浴鍋加熱2 h，震蕩、離心后加入α-MEM培養(yǎng)基中，混勻后轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37 ℃含5% 二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長到70% 左右進(jìn)行傳代，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

采用免疫熒光雙染方法鑒定hUCMSC的表型。取第3代培育細(xì)胞，以0.25% 胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，滴加于6孔板的爬片上，置入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中約6 h。然后以4%多聚甲醛固定，PBS清洗，1% 牛血清白蛋白孵育1 h。加入一抗(1∶1 000抗CD44和1∶200抗CD90)，平放于濕盒內(nèi)，4 ℃孵育過夜。然后以PBS清洗，加二抗孵育50 min，再予PBS清洗后滴加DAPI染液，避光下室溫孵育5 min后封片，熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8試劑盒分析納米銀及銀離子(硝酸銀提供)對hUCMSC的毒性作用。將hUCMSC以細(xì)胞密度5×103個(gè)/孔接種于96孔板，過夜培養(yǎng)；更換含有不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL)的納米銀生長培養(yǎng)液和不同質(zhì)量濃度(0、0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL)的硝酸銀生長培養(yǎng)液，均培養(yǎng)24 h，其中0 μg/mL作為對照；去除含納米銀、硝酸銀的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10% CCK-8溶液的生長培養(yǎng)基，孵育4 h；用酶標(biāo)儀在波長450 nm處讀取每孔溶液的吸光度(OD450)。通過以上實(shí)驗(yàn)得出納米銀及硝酸銀的最大安全質(zhì)量濃度，以此質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 納米銀和銀離子對hUCMSC成骨分化的影響

采用堿性磷酸酶(ALP)活力、茜素紅染色和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測納米銀及銀離子在最大安全質(zhì)量濃度(硝酸銀2 μg/mL、納米銀4 μg/mL)時(shí)對hUCMSC成骨分化的影響。后續(xù)實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，采用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSC：空白組采用 α-MEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS，1% 青霉素-鏈霉素雙抗)，硝酸銀組采用含2 μg/mL硝酸銀的α-MEM完全培養(yǎng)基，納米銀組采用含4 μg/mL納米銀的 α-MEM完全培養(yǎng)基。

ALP檢測：hUCMSC以細(xì)胞密度2×104個(gè)/孔接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長接近80% 融合時(shí)，分別以含硝酸銀 2 μg/mL和納米銀 4 μg/mL的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后去除含銀培養(yǎng)液，用pH 7.4的PBS沖洗3次，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)。于第3、7、14 d 采用 BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進(jìn)行染色，在倒置顯微鏡下觀察拍照。采用ALP試劑盒，根據(jù)說明書步驟測試ALP活力。于波長405 nm處測試其吸光度(OD405)，對ALP活力水平進(jìn)行定量分析。

茜素紅染色：hUCMSC的成骨誘導(dǎo)方法與ALP檢測時(shí)相同[13]。誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞用PBS沖洗3次，4%中性多聚甲醛固定30 min，茜素紅染液染色15 min[14]。沖洗去除未結(jié)合的茜素紅染液，顯微鏡觀察、拍照。為了定量細(xì)胞外的基質(zhì)礦化，用氯化十六烷基吡啶溶解結(jié)合的茜素紅，在波長562 nm處測試其吸光度(OD562)，并用總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

qRT-PCR測試：hUCMSC以細(xì)胞密度1×105個(gè)/孔接種于6孔板，按照上述方法進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。在第3、7、14 d，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，用PrimeScriptTMRT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，用SYBR Premix Ex TaqⅡ在Bio-Rad C1000 PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR分析，目的基因?yàn)镽unt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣蛋白(OCN)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)，其引物序列見表1。目的基因表達(dá)水平用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.6 肌動蛋白細(xì)胞骨架染色

將200 μL細(xì)胞懸液(每mL含2×104個(gè)細(xì)胞)滴于蓋玻片上，放于6孔板內(nèi)，等待4 h，待細(xì)胞貼片后加入2 mL生長培養(yǎng)液；過夜培養(yǎng)后，硝酸銀組和納米銀組分別加入含2 μg/mL硝酸銀和含4 μg/mL納米銀的α-MEM完全培養(yǎng)液，空白組加入α-MEM完全培養(yǎng)液，各組均孵育24 h。用PBS沖洗后，各組細(xì)胞用4% 中性多聚甲醛固定，0.5% 曲通 X-100打孔，然后分別用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色30 min和DAPI染色5 min，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架及細(xì)胞核的變化。

1.7 RhoA蛋白活力檢測

將hUCMSC以細(xì)胞密度1×105個(gè)/瓶接種于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生長接近80% 融合時(shí)，分別加入含2 μg/mL硝酸銀和4 μg/mL納米銀的 α-MEM完全培養(yǎng)液，作用24 h后用PBS沖洗。使用文獻(xiàn)報(bào)道的方法裂解細(xì)胞[15]，在4 ℃條件下，以3 000×g離心3 min，提取上清液。在上清液中加入Rho靶蛋白共軛的瓊脂糖微珠，在4 ℃條件下孵育45 min，以3 000×g離心3 min，用沖洗緩沖液清洗，最后重懸于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液中。使用蛋白免疫印跡法測定，β-actin蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)量化蛋白。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米銀的形態(tài)及大小

透射電鏡顯示，納米銀為圓形或類圓形的散在顆粒，大小較均一，見圖1。納米銀顆粒直徑為(18.8±4.2)nm，其中直徑約20 nm顆粒占比最高，達(dá)44.5%，見圖2。

圖1 透射電鏡下納米銀形態(tài)

圖2 納米銀顆粒直徑分布

2.2 hUCMSC的分離及鑒定

hUCMSC在原代培養(yǎng)約7 d可看到細(xì)胞貼壁，鏡下見細(xì)胞呈多邊形、梭型、紡錘形，增殖活力較強(qiáng)。免疫熒光雙染顯示hUCMSC同時(shí)表達(dá)CD 44和CD 90，表明分離培養(yǎng)所得細(xì)胞是hUCMSC。見圖3。

圖3倒置顯微鏡下hUCMSC免疫熒光雙染圖像(×200) a. CD 90顯示綠色熒光 b. CD 44顯示紅色熒光 c. DAPI染色示細(xì)胞核為藍(lán)色(箭頭所示) d. a、b和c的合成圖。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與0 μg/mL組比較，硝酸銀質(zhì)量濃度達(dá)到4 μg/mL時(shí)OD450值明顯下降[(1.96±0.14)對(1.00±0.11)，P=0.002]，納米銀質(zhì)量濃度達(dá)到8 μg/mL時(shí)OD450值明顯下降[(1.91±0.08)對(0.98±0.16)，P<0.01]。也就是說，直到納米銀質(zhì)量濃度達(dá)到4 μg/mL，或硝酸銀質(zhì)量濃度達(dá)到2 μg/mL時(shí)，對細(xì)胞無明顯毒性作用。見下頁圖4。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選用最大安全質(zhì)量濃度納米銀4 μg/mL、硝酸銀2 μg/mL進(jìn)行。

圖4 不同質(zhì)量濃度納米銀及硝酸銀的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 對成骨分化的影響

2.4.1 ALP檢測

對hUCMSC進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)第3、7、14 d后ALP顯色檢測顯示，與空白組和硝酸銀組相比納米銀組細(xì)胞著色更深，表明細(xì)胞內(nèi)ALP 含量更高，見圖5。ALP 定量檢測顯示，誘導(dǎo)3 d后，空白組、硝酸銀組和納米銀組的OD405值分別為(0.44±0.14)、(0.46±0.04)和(0.52±0.12),各組之間無差異(P均>0.05)；誘導(dǎo)7 d后，空白組、硝酸銀組和納米銀組的OD405值分別為(1.14±0.14)、(1.07±0.25)和(1.42±0.16)，空白組與硝酸銀組比較無差異(P=0.59)，空白組和硝酸銀組均明顯低于納米銀組(P=0.002和P=0.001)。誘導(dǎo)14 d后，空白組、硝酸銀組和納米銀組的OD405值分別為(1.85±0.20)、(1.81±0.22)和(2.31±0.39)，空白組與硝酸銀組比較無差異(P=0.83)，空白組和硝酸銀組均低于納米銀組(P=0.02 和P=0.017)。

圖5 hUCMSC成骨分化誘導(dǎo)后ALP 染色情況

2.4.2 茜素紅染色

hUCMSC成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色顯示，與空白組及硝酸銀組相比，納米銀組有更多的礦化結(jié)節(jié)，見圖6。定量測試OD562值分別為空白組(0.60±0.08)、硝酸銀組(0.51±0.16)和納米銀組(1.06±0.18),空白組與硝酸銀組比較無差異(P=0.33)，空白組和硝酸銀組均明顯低于納米銀組(P=0.002和P=0.001)。

圖6 茜素紅染色檢測細(xì)胞外基質(zhì)礦化鈣結(jié)節(jié)的顯微圖片(×100)

2.4.3 qRT-PCR檢測結(jié)果

與空白組相比，硝酸銀組在培養(yǎng)3、7、14 d后，成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平無明顯差異(P均>0.05)。與空白組相比，納米銀組培養(yǎng)3 d后Runx2、OCN、OPN、COL1A1的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P均<0.05)，培養(yǎng)7 d后Runx2、OCN、BMP-2、OPN、COL1A1的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P均<0.05)，培養(yǎng)14 d后Runx2、OCN、BMP-2、OPN的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P均<0.05)。見表1。

表1 納米銀和硝酸銀對hUCMSC成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

注：F、P為3組單因素方差分析，P1為硝酸銀組與空白組比較，P2為納米銀組與空白組比較，P3為硝酸銀組與納米銀組比較

2.4.4 肌動蛋白細(xì)胞骨架的聚合

肌動蛋白細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，空白組hUCMSC為正常的肌動蛋白應(yīng)力纖維染色，納米銀組的絲狀肌動蛋白染色強(qiáng)于硝酸銀組及空白組。該結(jié)果表明，納米銀促進(jìn)了肌動蛋白聚合，而硝酸銀無此作用。見圖8。

圖8 肌動蛋白細(xì)胞骨架染色圖像 羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色后絲狀肌動蛋白顯示紅色，DAPI染色后細(xì)胞核顯示藍(lán)色

2.4.5 RhoA蛋白活力

空白組、硝酸銀組和納米銀組的總RhoA蛋白水平相似。GTP-RhoA/Total-RhoA比值分別為空白組(0.56±0.036)、硝酸銀組(0.51±0.07)和納米銀組(0.87±0.04)，空白組與硝酸銀組無差異(P=0.54)， 納米銀組高于空白組(P=0.003)，也高于硝酸銀組(P=0.026)，說明納米銀提高了活化Rho蛋白水平，而硝酸銀無此作用。見圖9。

圖9 蛋白質(zhì)印跡法檢測活化RhoA蛋白水平 a. 蛋白表達(dá)顯影條帶 b. 灰度值定量分析蛋白表達(dá)*P<0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)成功分離出hUCMSC。

我們發(fā)現(xiàn)納米銀及硝酸銀對hUCMSC的細(xì)胞毒性作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當(dāng)納米銀質(zhì)量濃度超過4 μg/mL、硝酸銀質(zhì)量濃度超過2 μg/mL時(shí)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用。故我們采用最大安全質(zhì)量濃度納米銀4 μg/mL、硝酸銀2 μg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的納米銀最低抑菌濃度(對酵母菌為0.7 ng/mL，對大腸桿菌為0.35 ng/mL，對金黃色葡萄球菌為3.5 ng/mL)[16]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米銀可促進(jìn)hUCMSC的成骨分化水平，而硝酸銀則對成骨分化沒有影響。Mahmood等[17]報(bào)道，一些納米材料(含納米銀)可提高M(jìn)C3T3-E1成骨細(xì)胞的礦化水平，這與我們的研究結(jié)果相似。他們認(rèn)為，該作用是通過納米銀刺激成骨相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)產(chǎn)生的。通過qRT-PCR，我們檢測了hUCMSC成骨相關(guān)基因的表達(dá)。硝酸銀作用3 d后，hUCMSC的成骨相關(guān)基因表達(dá)無明顯變化。然而，納米銀作用后，成骨相關(guān)基因表達(dá)水平顯著提高。結(jié)合納米銀促進(jìn)ALP活力及提高細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平的作用，我們可以推斷出納米銀是通過上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，來提高h(yuǎn)UCMSC的成骨分化能力。

然而，納米銀通過什么途徑提高干細(xì)胞的成骨分化呢？Huang等[18]報(bào)道，介孔氧化硅納米顆?？梢曰罨疪hoA蛋白，引起細(xì)胞肌動蛋白聚合，進(jìn)而激活hUCMSC的成骨分化通路，促進(jìn)成骨分化。已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，高水平的活化狀態(tài)RhoA蛋白和高張力的細(xì)胞骨架可以誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化[15, 19-21]。McBeath等[15]認(rèn)為，干細(xì)胞的活化RhoA可使干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而非活化的RhoA則使干細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化，并證明該作用是通過激活Rho蛋白激酶，從而增加細(xì)胞骨架張力引起。Arnsdorf等[20]報(bào)道，RhoA蛋白激活可以提高細(xì)胞骨架張力，這是干細(xì)胞成骨分化的必要條件。因此我們猜測，納米銀也是通過上調(diào)活化RhoA蛋白水平，增加細(xì)胞骨架張力，來促進(jìn)hUCMSC成骨分化。我們采用鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞的肌動蛋白張力纖維。實(shí)驗(yàn)顯示，hUCMSC經(jīng)納米銀作用后，肌動蛋白纖維增粗，顯影清晰，聚合水平增高；而經(jīng)硝酸銀作用后，與空白組相比無顯著變化?；罨疪hoA蛋白定量檢測顯示，納米銀提高了活化RhoA蛋白水平，而硝酸銀則無此改變。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米銀通過上調(diào)活化RhoA蛋白水平，促進(jìn)干細(xì)胞肌動蛋白聚合，提高h(yuǎn)UCMSC的成骨分化能力。

納米銀是如何上調(diào)活化RhoA蛋白水平的呢？ Khatiwala等[19]報(bào)道，細(xì)胞培養(yǎng)基底材料的變化可通過結(jié)合在胞漿膜上整合素的變化激活下游蛋白絡(luò)氨酸激酶，進(jìn)一步催化RhoA蛋白。當(dāng)納米銀作用于hUCMSC后，可粘附于細(xì)胞表面，這在一定程度上可看作培養(yǎng)基底改變。納米銀通過與某些特定整合素結(jié)合，引起RhoA蛋白活化，而其具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

本研究顯示，納米銀在4 μg/mL時(shí)無毒性作用的。在此濃度，納米銀可以活化RhoA蛋白，誘導(dǎo)肌動蛋白聚合，增加細(xì)胞骨架張力，最終促進(jìn)hUCMSC的成骨分化。因?yàn)橄跛徙y(提供銀離子)無此作用，我們認(rèn)為，納米銀是通過其本身而非釋放的銀離子產(chǎn)生上述作用的。納米銀可以和hUCMSC共存并用于組織工程支架，為臨床骨缺損的修復(fù)提供可能。

本研究是為以后在組織工程支架上同時(shí)加載納米銀及hUCMSC修復(fù)骨缺損所做的前期研究。納米銀可以因大小[12]、形狀[22]及表面包被材料[23]不同而具有不同性能，因此，不同種類納米銀對干細(xì)胞的作用還需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。