鄭孝振，韓簫笛，宋俊杰，毛姍姍，白明松，洪道先

（河南大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 475000）

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）為細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導分子，細胞中分布廣泛，生物學功能復雜。當外周神經(jīng)發(fā)生損傷后，脊神經(jīng)纖維會釋放出大量的降鈣素基因相關(guān)肽和興奮性氨基酸[1-2]，通過激活脊髓背角神經(jīng)元的突觸后膜，產(chǎn)生快速的突觸電位，從而解除NMDA受體上的壓力，激活NMDA受體，開放鈣離子，進一步增加NMDA受體的數(shù)量，增強突觸后神經(jīng)元的興奮性。有研究報告表明，舒芬太尼可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛程度[3-4]。本研究旨在評價鞘內(nèi)注射舒芬太尼對神經(jīng)性痛大鼠脊髓背角內(nèi)NMDA受體表達的影響，為舒芬太尼在慢性神經(jīng)痛中的應用途徑、劑量以及效果提供參考依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取健康清潔級成年雄性SD大鼠，購自上海生工動物實驗中心，體質(zhì)量200～250 g，自由進食，溫度22℃～25℃，濕度55%左右，晝夜比1︰1，適應環(huán)境1周后進行實驗分組。隨機選擇5只作為空白對照組，其余大鼠制備慢性坐骨神經(jīng)損傷模型，造模成功后隨機分為模型組和觀察組，各15只。

1.2 制備慢性神經(jīng)痛模型

大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，側(cè)臥位固定，距股骨下1 cm沿股骨走形切開皮膚，鈍性分離充分顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)和周圍組織，游離主干分叉以前約8 mm，含鉻羊腸線在神經(jīng)起始點2 mm處將坐骨神經(jīng)結(jié)扎4道，每道相隔1 mm，局部生理鹽水沖洗，間斷縫合皮下組織。以大鼠出現(xiàn)縮足、舔尾等行為，疼痛陽性反應為建模成功。

1.3 實驗方法

觀察組鞘內(nèi)注射舒芬太尼1 μg+氯化鈉注射液稀釋至10 μL，模型組注射等量0.9%氯化鈉注射液；分別于造模后即刻、3 d和5 d評價運動功能，熱縮足反射潛伏期法（TWL）檢測疼痛閾值，免疫組化染色法檢測脊髓背角NMDA受體陽性表達。

1.4 鞘內(nèi)注射

建模后2 h大鼠吸入異氟烷麻醉，俯臥位固定，選取L3～L4間隙為切口位置，縱形切口長度3 cm，鈍性分離肌肉組織，顯露L3～L4脊突間隙；利用25 G針穿刺黃韌帶和硬脊膜，待腦脊液流出視為穿刺成功。將導管經(jīng)硬脊膜口緩慢插入8 cm，開口端固定于L1～L2，另一端經(jīng)皮下隧道在頸背部引出，外露2 cm將導管口夾閉并固定。待大鼠麻醉失效后，微量注射10 μL舒芬太尼或0.9%氯化鈉注射液，以10 s內(nèi)雙肢出現(xiàn)無法負重、無逃避反應且20 min可恢復為注射成功。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 運動功能評分：0分為運動功能無改變，可以正常行走；1分為運動輕度受限，足底刺激可出現(xiàn)正?？s爪反應；2分為自主運動能力減低，中度運動受限；3分為自主活動完全受限，無法行走。

1.5.2 疼痛閾值檢測：把大鼠放在有機玻璃箱中，置于玻璃板上，適應30 min后，采用紅外線光束照射大鼠術(shù)側(cè)足底中部，至大鼠表現(xiàn)逃避性行為終止，熱刺激基礎強度設定10 s，自動切斷時間設定20 s，每只大鼠測量5次，間隔時間5 min，取平均值。

1.5.3 免疫組化染色法：常規(guī)制作脊髓背角組織切片，厚度5 μm，經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復和封閉后；滴加兔抗鼠NMDA受體單克隆抗體一抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰2000），置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌；滴加羊抗兔IgG多克隆抗體二抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰500），置于濕盒中27℃孵育20 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（江蘇碧云天科技有限公司），置于濕盒中27℃孵育20 min，PBS振蕩洗滌5 min×3次；DAB顯色、復染、透明、中性樹膠封片、光學顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：采用半定量法，依據(jù)染色強度和染色細胞所占比率；以胞漿或胞核黃染至深棕色為陽性，染色強度中無陽性染色為0分，弱染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分；陽性細胞數(shù)比率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩項乘積0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 運動功能評分的比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運動功能評分高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d運動功能評分逐漸下降，顯著低于造模后即刻，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 運動功能評分比較

2.2 疼痛閾值比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 疼痛閾值的比較

2.3 脊髓背角NMDA受體陽性表達比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d陽性表達較造模后即刻逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組不同時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3

表3 脊髓背角NMDA受體陽性表達比較

3 討論

本實驗采用大鼠作為研究對象，大鼠選擇性神經(jīng)損傷模型（SNI）引起的神經(jīng)損傷程度穩(wěn)定，且重復性好，誘發(fā)行為表現(xiàn)更加持久，損傷傳入神經(jīng)元，能夠模擬臨床上神經(jīng)病理性疼痛的特征，是一種較為穩(wěn)定的大鼠模型。本研究探討舒芬太尼減輕神經(jīng)病理性疼痛的機制，選擇術(shù)后各個時間點進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對照組明顯降低；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻顯著升高，差異顯著；模型組不同時間點的疼痛閾值比較差異無統(tǒng)計學意義。說明鞘內(nèi)注射舒芬太尼對神經(jīng)性痛大鼠的痛覺有顯著改善作用，可減輕神經(jīng)疼痛。造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運動功能評分顯著高于對照組；觀察組3 d和5 d運動功能評分逐漸下降，顯著低于造模后即刻；模型組不同時間點的運動功能評分比較差異無統(tǒng)計學意義。說明舒芬太尼可以在減輕大鼠神經(jīng)痛的同時，恢復大鼠的運動功能。造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達顯著高于對照組；觀察組3 d和5 d陽性表達較造模后即刻逐漸降低，差異顯著。說明建模后大鼠脊髓背角NMDA受體量及陽性表達量增加，使用舒芬太尼后可降低大鼠脊髓背角NMDA的陽性表達，可能是通過抑制降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）激活和NMDA釋放有關(guān)。大鼠發(fā)生神經(jīng)痛后，導致CGRP表達和脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體上調(diào)，提示這兩種受體均參與了神經(jīng)病理性疼痛的維持和形成。舒芬太尼可通過下調(diào)這兩種受體的表達，來減輕疼痛感，但具體作用機制需要進一步研究討論。

綜上所述，鞘內(nèi)注射舒芬太尼可減少神經(jīng)痛大鼠脊髓背角NMDA受體的表達，減輕疼痛感，增強運動能力。該研究的創(chuàng)新點在于為舒芬太尼在慢性神經(jīng)痛中的應用途徑以及效果提供參考依據(jù)，但是未能深入分析舒芬太尼對NMDA受體不同亞型的表達水平及作用效應，觀察時間有限，舒芬太尼對慢性神經(jīng)痛的遠期干預效果還需要進一步驗證。