劉娜，潘雯，張紅霞

（1. 西寧聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，甘肅 蘭州 730000；2. 廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510000）

油酸是一種常見的藥用輔料，該品種在現(xiàn)行版美國(guó)藥典（USP）、英國(guó)藥典（BP）、歐洲藥典（EP）輔料中都有收載，但無(wú)微生物限度檢查項(xiàng)，在中國(guó)藥典（CHP）及日本藥典（JP）中均未收載該品種；USP、EP、CHP中僅規(guī)定藥用輔料限度為需氧菌總數(shù)不得過(guò)103CFU/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過(guò)102CFU/g。本文通過(guò)試驗(yàn)，首次確定了油酸的微生物限度檢查方法，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。

1 儀器與試藥

1.1 樣品

油酸原料藥：生產(chǎn)企業(yè)：德國(guó)Lipoid Gmgh公司；批號(hào)：520200-2150681；520200-2150682；520200-2150683

1.2 試驗(yàn)環(huán)境

在C級(jí)受控潔凈環(huán)境，局部A級(jí)單向流空氣的無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行。陽(yáng)性菌操作在符合國(guó)家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.3 適用性試驗(yàn)用菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC(B)26003] 、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001] 、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 的冷凍干燥第0代菌種，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇和確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)中使用第三代培養(yǎng)物。

1.4 稀釋液

pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào):151103），由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.5 儀器

HVE-50型高壓滅菌器（日本HIRAYAMA)；PL602-L型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HVE-50BSC-1360A2 型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；SLI-1200型恒溫培養(yǎng)箱（上海愛朗儀器有限公司）；MJPS-250型霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；JLQ-S1型菌落計(jì)數(shù)器（江蘇無(wú)錫市電化教具廠）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；DK-S型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.6 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：170523），沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：170706），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：170613)，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：170627），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：1704242），麥康凱瓊脂（批號(hào)：170330），卵磷脂吐溫80醇液（批號(hào)：160422）（含0.1%卵磷脂，0.7%吐溫80），聚山梨酯80，均由北京三藥科技開發(fā)公司提供，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果證明上述批次的培養(yǎng)基均符合2015年版中國(guó)藥典要求。

2 方法

2.1 常規(guī)法

采用常規(guī)法對(duì)3批樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。

2.2 菌液的制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24小時(shí)。接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)2～3天，備用。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5～7天，洗脫孢子，備用。以上試驗(yàn)菌用無(wú)菌生理鹽水按10倍稀釋使接入菌量不大于100 cfu，備用。

2.2 稀釋劑的選用

經(jīng)試驗(yàn)考察，最終確定選用含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 供試液的制備無(wú)菌吸取油酸10 mL，加含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，作為1︰10的供試液。

2.3.2 供試品對(duì)照組取1：10供試液1 mL，傾注含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，30℃～35℃，培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃～25℃，培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。

2.3.3 稀釋劑對(duì)照組取含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

2.3.4 試驗(yàn)組取5支試管各加入1∶10供試液9.9 mL，每管分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉0.1 mL，從試管中取1 mL，操作方法如2.3.2供試品對(duì)照組，傾注含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，30℃～35℃，培養(yǎng)3天；另取2支試管各加入1∶10的供試液9.9 mL，每管分別加入白色念珠菌、黑曲霉0.1 mL，從試管中取1 mL同上操作，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃～25℃，培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。

2.3.5 菌液組取pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。(注：所加菌液的體積不超過(guò)供試液體積的1%。)

2.3.6 回收率計(jì)算公式

2.3.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

供試品制備成含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的1︰10供試液，采用常規(guī)法對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉進(jìn)行試驗(yàn)，在含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的TSA平板上的比值均在0.5～2范圍內(nèi)；對(duì)白色念珠菌、黑曲霉進(jìn)行試驗(yàn)，在SDA平板上的比值均在0.5～2范圍內(nèi)。見表1和表2。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法驗(yàn)證

大腸埃希菌檢查采用常規(guī)法，按照《中國(guó)藥典》2015年版四部[1]大腸埃希菌檢查方法檢查。結(jié)果表明，供試品的大腸埃希菌檢查可采用常規(guī)法檢驗(yàn)。見表3。

表3 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

2015年版中國(guó)藥典的施行，微生物限度檢查方法在操作和培養(yǎng)基都有了非常大的改變，針對(duì)具體品種的特點(diǎn)，需要通過(guò)培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)來(lái)確定檢驗(yàn)方法的可行性。

本文分別采用常規(guī)法、薄膜過(guò)濾法、培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明薄膜過(guò)濾法回收率和培養(yǎng)基稀釋法回收率都不符合規(guī)定要求；并且樣品黏稠，具有吸附性，薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)操作難度大。常規(guī)法分別考察了①稀釋液加20 mL十四烷酸異丙酯，萃取取下層；②稀釋液加2%卵磷脂醇液；③TSA瓊脂加1%卵磷脂醇液。這三種方法均不符合回收率要求。最終確定取本品10 g，加含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1︰10的供試液，按平皿法，傾注含0.1%卵磷脂和0.7%聚山梨酯80的胰酪大豆胨瓊脂，依法檢查（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則＜1105＞與＜1106＞）。

該品種在現(xiàn)行版USP、BP、EP中有收載，但無(wú)微生物限度檢查項(xiàng)，在CHP及JP中均未收載；USP、EP、CHP中藥用輔料限度為：需氧菌總數(shù)不得過(guò)103CFU/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過(guò)102CFU/g,結(jié)合進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，最終確定限度為每1 g供試品中需氧菌總數(shù)不得過(guò)100 cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)不得過(guò)20 cfu，每1 g不得檢出大腸埃希菌[2-4]。該方法操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)菌回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，控制菌均能檢出，方法可行。