溫丹華，李葉麗，史曉亞，黃登宇

1(山西大學 生命科學學院，山西 太原，030006) 2(山西大學 食品藥品快速檢測中心，山西 太原，030006) 3(山西省市場監(jiān)督管理局，山西 太原，030006)

老陳醋是山西省地理標志產(chǎn)品之一，因其獨特的制作工藝、風味及營養(yǎng)價值[1]而受到大家歡迎，有“天下第一醋”美譽，已被列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。但以低齡醋冒充高齡醋欺騙消費者的情況還時有發(fā)生。川芎嗪是山西老陳醋中特征性成分之一，具有抗血栓[2-4]、抗腫瘤[5-7]作用，對人體消化、呼吸等系統(tǒng)具有保護作用[8-11]，其含量在存放期間隨著陳放時間的延長逐漸增多[12]。

目前檢測川芎嗪的方法主要是傳統(tǒng)儀器檢測法：高效液相色譜法[13-15]、紫外分光光度法[16-17]、近紅外光譜檢測法[18-20]等。雖檢測結(jié)果準確，但儀器龐大不易攜帶，前處理相對復雜，檢測周期長，不適合現(xiàn)場大批量快速篩查[21-22]，而便攜式激光拉曼檢測儀[23]小型便攜、操作簡單、檢測速度快，適合執(zhí)法部門在繁重的日常抽檢中使用。本研究建立了基于川芎嗪的山西老陳醋醋齡拉曼光譜快速檢測方法，該法檢測速度快、準確度高、操作簡單，不僅適用于實驗室檢測，也非常適合執(zhí)法部門現(xiàn)場快速篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋,太原寧化府益源慶醋業(yè)有限公司(分別為：新醋、醋齡1、1.5、3、4、5年醋)。

鹽酸川芎嗪, 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪鹽酸鹽(C8H12N2·HCl)(≥98%),北京索萊寶科技有限公司；CCl3(AR),ACN(AR),HCl(AR),CH3CH2OH(CR),天津市申泰化學試劑有限公司；NaOH(AR),NH4H2PO4(AR),天津進豐化工有限公司；納米增強檢測試劑OTR202，OTR103,蘇州歐普圖斯光學納米科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S電子天平(d=0.01 g)、pH計,德國Sartorius公司；UPT-I-10T超純水器,四川優(yōu)普超純科技有限公司；SC-3610低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司；RanTracer-200-QCM便攜式激光拉曼光譜儀,上海美譜達儀器有限公司；高效液相色譜儀(紫外檢測器),美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

鹽酸川芎嗪標準液：參照文獻[24]的方法配制。將1 mg/mL川芎嗪標準液分別稀釋到5、10、25、50、100、200、500 μg/mL備用。

1.3.2 樣品前處理

由于川穹嗪含量是隨著年份增加逐漸增加[12]，含量多的時候測定相對準確，穩(wěn)定性更高，但由于4年醋和5年醋的樣品黏稠度太大，提取存在不徹底的可能，因此實驗中選擇3年醋。

取3年陳放期山西老陳醋10 mL，加NaOH溶液至pH>8，加5 mL CHCl3，萃取。4 000 r/min離心15 min，合并CHCl3相。添加0.2 mol/L HCl 4.4 mL萃取，合并水相，用dH2O定容至10 mL。

取3年陳放期老陳醋待測液，分別加入100、200、500 μg/mL鹽酸川芎嗪標準品。

1.3.3 條件參數(shù)

便攜式激光拉曼光譜儀系統(tǒng)參數(shù)：拉曼光譜范圍250～2 400 cm-1，激光波長785 nm，CCD像素2 048，光學分辨率<6 cm-1。

條件參數(shù)：激光輸出功率200 mW，積分時間10 s，積分次數(shù)2，平滑系數(shù)5，納米增強試劑V(OTR 202)∶V(OTR103)=5∶1。

1.3.4 川穹嗪拉曼特征峰確定

檢測瓶中加入600 μL乙腈溶液進行檢測，自動進行基線校正。

向檢測瓶中依次加入500 μL納米增強試劑OTR202、20 μL待測液、100 μL OTR103，振蕩后迅速放入檢測池開始檢測。

對3年陳釀期老陳醋待測液按上述實驗方法進行檢測，再分別在待測液中添加100、200、500 μg/mL鹽酸川芎嗪標準液(體積比為1∶1)進行檢測，保存檢測結(jié)果，對譜圖進行分析。

用上述實驗方法對配制好的1 mg/mL鹽酸川芎嗪標準液進行檢測，檢測結(jié)果與理論計算的拉曼光譜進行比較分析。

1.3.5 檢測方法條件優(yōu)化

待測液按1.3.2方法進行前處理，按照1.3.4實驗流程進行檢測，對主要影響因素(積分時間、積分次數(shù)、平滑系數(shù)、激光輸出功率、樣品量)進行單因素優(yōu)化實驗，測定各檢測液峰強。積分時間分別設置為2、5、10、15、20、30 s；積分次數(shù)為1、2、5、10、15；平滑系數(shù)為2、5、15、20；功率分別為200、250、300、350 mW；檢測樣品量分別為20、40、50、100 μL。確定各水平最佳范圍。

1.3.6 基于川穹嗪的山西老陳醋醋齡拉曼檢測方法的建立和評價

1.3.6.1 川穹嗪拉曼光譜檢測法標準曲線建立

分別對10、25、50、100、200 μg/mL川穹嗪標準溶液進行檢測，建立標準曲線并計算相關(guān)性。

1.3.6.2 方法建立

按照1.3.2方法對所取樣品(新醋、陳放期為1、1.5、3、4、5年山西老陳醋)進行前處理，每個年份取3個樣品平均值，以醋齡為橫坐標，3次檢測峰強平均值為縱坐標作圖。

1.3.6.3 方法評價

(1)精密度。取3年醋齡樣品經(jīng)前處理檢測，同一樣品重復5次，計算相對標準偏差(RSD)，以RSD值表示該方法的精密度，如公式(1)所示。

(1)

式中：X，特征峰峰強；n=5。

(2)重現(xiàn)性。取3年醋齡山西老陳醋10份，每份樣品經(jīng)前處理后進行檢測，記錄特征峰峰強，以RSD表示該方法重現(xiàn)性。

(3)添加回收率。取3年醋齡山西老陳醋前處理液，分別加入0.025、0.05、0.1 mg川芎嗪標準品，每組3個平行取平均值，計算加標回收率和變異系數(shù)。

1.3.6.4 高效液相色譜法測定山西老陳醋醋齡

色譜柱為Venusil ASB C18(150 mm×4.6 mm)，流動相為V(0.2 mmol/L磷酸二氫銨溶液)∶V(色譜甲醇)=5∶5，流速是0.8 mL/min，紫外檢測器檢測波長為279 nm，柱溫是20 ℃，進樣量為10 μL。

在上述色譜條件下將5、10、25、50、100、200 μg/mL川芎嗪標準液分別進樣10 μL進行檢測，重復3次取平均值，以色譜峰響應值為縱坐標，以樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣品經(jīng)過前處理，按照上述色譜條件分別取樣10 μL進入色譜儀檢測，根據(jù)標曲計算其川芎嗪含量，進而得出醋齡。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定川穹嗪拉曼特征峰

通過對譜圖分析，結(jié)果顯示在拉曼位移1 599 cm-1處川芎嗪拉曼峰峰形較好，且隨著添加標品量的增多，峰強呈線性關(guān)系，與標品特征峰對應非常好，故初步選為本研究特征峰。

2.1.2 確定特征峰

圖1是鹽酸川穹嗪理論計算拉曼光譜，圖2是鹽酸川穹嗪實驗拉曼光譜。結(jié)合量子化學理論密度泛函理論方法計算得到鹽酸川穹嗪理論拉曼譜圖，通過高斯View 5.0對理論鹽酸川芎嗪分子振動模式進行觀察，并與實驗譜圖比較，進行拉曼峰歸屬分析，可以看出理論計算和實驗測得的鹽酸川芎嗪拉曼光譜基本一致。在768、1 533 cm-1處的峰在實驗檢測中沒有出現(xiàn)，是因為理論計算與實際分子振動中存在一定的誤差，705、736、1 031、1 239、1 300、1 353、1 572、1 599 cm-1等處的峰都是環(huán)振動引起，在1 599 cm-1處峰與理論譜圖位置基本一致，且峰型較好。

圖1 鹽酸川穹嗪理論計算拉曼圖譜Fig.1 Theoretical Raman spectrum of ligustrazine hydrochloride

圖2 鹽酸川穹嗪實驗拉曼圖譜Fig.2 Experimental Raman spectrum of TMP

2.2 檢測條件優(yōu)化

2.2.1 積分時間優(yōu)化

對樣品前處理后，設置激光輸出功率為200 mW、積分次數(shù)2、平滑系數(shù)5、樣品量20 μL、納米增強試劑：OTR202和OTR103分別為500 μL和100 μL，積分時間分別設置為2、5、10、15、20、30 s，綜合考慮特征峰強度和檢測時間，在保證快速檢測前提下獲得較強特征峰強度，且峰強未發(fā)生衰減的時間為最優(yōu)積分時間。

將拉曼位移1 599 cm-1特征峰放大后如圖3所示?？梢钥闯?，隨著積分時間增加，峰強不斷增加，積分時間20 s時峰強最高，當積分時間增加到30 s時，峰強明顯降低，故選擇積分時間20 s為最佳積分時間。

圖3 積分時間優(yōu)化Fig.3 Optimization of integral time

2.2.2 積分次數(shù)優(yōu)化

按2.2.1得到的優(yōu)化條件，設置積分次數(shù)為1、2、5、10、15，操作流程同2.2.1進行檢測，在保證快速檢測的前提下獲得較強特征峰強度，且峰強未發(fā)生衰減次數(shù)為最優(yōu)積分次數(shù)。

對于曾先生的解釋，兩名警察沒有過多回應，而是指示旅店保安將曾先生弄出去，曾先生也配合著出去了，然后就看到父親被兩名警察一前一后抬了出來。但曾先生的母親告訴曾先生，警察在旅店內(nèi)先是將曾先生父親從沙發(fā)上拽下來，然后倒著將其拖出來，到旅店門口才換成兩個人抬著。此時，曾先生的母親也從旅店出來，并哭著給躺在地上、已經(jīng)有些意識不清的曾先生父親喂藥。

圖4 積分次數(shù)優(yōu)化Fig.4 Optimization of number of integral times

由圖4可以看出，積分次數(shù)在1～10，隨著積分次數(shù)增加，峰強不斷增加，積分次數(shù)為10時峰強最高，當積分次數(shù)變?yōu)?5時，峰強降低，故選擇積分次數(shù)10作為最佳積分次數(shù)。

2.2.3 平滑系數(shù)優(yōu)化

上述優(yōu)化條件下，設置平滑系數(shù)為2、5、15、20，操作流程和判斷依據(jù)同2.2.1。從圖5可以看出平滑系數(shù)越大，譜線越光滑，但平滑系數(shù)過大會使結(jié)果失真，圖中平滑系數(shù)20時譜線明顯有偏移且峰強降低，在平滑系數(shù)為15時，峰型最好且峰強最高，此時的平滑系數(shù)更有利于譜圖分析，故選擇平滑系數(shù)15為最佳平滑系數(shù)。

圖5 平滑系數(shù)優(yōu)化Fig.5 Optimization of the smoothness coefficient

2.2.4 功率優(yōu)化

在上述最優(yōu)條件下，設置功率分別為200、250、300、350 mW，操作流程和判斷依據(jù)同2.2.1。

圖6結(jié)果顯示，當激光功率從200 mW增加到300 mW時，特征峰峰強越來越高，功率為350 mW時峰強降低，300 mW時峰強最高且峰型較好，所以選擇300 mW為最佳激光照射功率。

圖6 功率優(yōu)化Fig.6 Optimization of power

2.2.5 樣品量優(yōu)化

在上述最優(yōu)條件下，設置檢測樣品量分別為20、40、50、100 μL，操作流程和判斷依據(jù)同2.2.1。從圖7可以看出，加樣量為20 μL時信號最強，選擇此加樣量為最佳加樣量。

圖7 加樣量優(yōu)化Fig.7 Optimization of addition quantity

2.2.6 結(jié)果分析

拉曼光譜檢測各參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如2.2.1～2.2.5所示，當積分時間為20 s，積分次數(shù)為10次，平滑系數(shù)為10，功率為300 mW，樣品量為20 μL時，特征峰位置處峰強最高，因此選擇此條件作為山西老陳醋中川芎嗪拉曼檢測方法的最優(yōu)檢測條件。

2.3 基于川穹嗪的山西老陳醋醋齡拉曼檢測方法建立與評價

2.3.1 繪制標準曲線

2.3.1.1 拉曼光譜法

拉曼光譜法檢測川芎嗪的標準曲線線性回歸方程為：y=5.568 7x+2 737.2(R2=0.925 1)，結(jié)果表明拉曼位移1 599 cm-1處川芎嗪質(zhì)量濃度在10～200 μg/mL與峰強具有較好的線性關(guān)系。

2.3.1.2 高效液相色譜法

高校液相色譜法測定川芎嗪濃度的標準曲線回歸方程為：y= 0.647 2x-4.027 6(R2=0.999 1)，結(jié)果表明，川芎嗪質(zhì)量濃度在5～200 μg/mL，與液相色譜響應值具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 不同醋齡山西老陳醋中川芎嗪含量測定

2.3.2.1 拉曼光譜法

不同醋齡山西老陳醋中川芎嗪含量拉曼檢測結(jié)果見圖8，可以看出隨著醋齡增加，川芎嗪含量不斷增加，且醋齡從1年增加到5年，川芎嗪含量增加幅度基本呈線性增加，線性關(guān)系為：y=501.52x+1 150.6，R2=0.982 5。

圖8 山西老陳醋醋齡拉曼光譜檢測Fig.8 Detection of vinegar age by SRES

2.3.2.2 高效液相色譜法

不同醋齡山西老陳醋中川芎嗪含量高效液相色譜檢測結(jié)果見圖9，隨著醋齡增加，川芎嗪含量不斷增加，且在醋齡達到1.5年之后，川芎嗪含量隨陳放時間的增加，趨勢接近線性增加，3～5年醋齡川芎嗪增加趨勢線性方程為：y=32.075x-60.183，R2=0.992 2，帶入標曲中計算得到5年醋齡的山西老陳醋中川芎嗪含量達到162 μg/mL。

圖9 山西老陳醋醋齡高效液相色譜法檢測Fig.9 Detection of vinegar age by HPLC

2.3.3 方法評價

表面增強拉曼光譜檢測山西老陳醋醋齡的檢測方法精密度、重現(xiàn)性、加標回收率及變異系數(shù)結(jié)果見表1，其中精密度RSD在2.3%～3.6%，重現(xiàn)性RSD在1.6%～3.2%，加標回收率在80.5%～87.2%，變異系數(shù)在5.1%～9.8%。高效液相色譜法檢測山西老陳醋醋齡的精密度、加標回收率、變異系數(shù)見表2。

表1 SERS法方法評價Table 1 Evaluation of SRES

通過比較表1和表2數(shù)據(jù)可以看到，表面增強拉曼光譜法檢測川芎嗪含量具有較高的準確度。同時表面增強拉曼檢測方法重現(xiàn)性較好，在加標量分別為25、50、100 mg/mL時該方法的變異系數(shù)均小于10%，能夠滿足實驗室及現(xiàn)場快速檢測要求。

表2 HPLC法方法評價Table 2 Evaluation of HPLC

3 結(jié)論

本研究通過拉曼光譜檢測法成功為地標產(chǎn)品山西老陳醋的質(zhì)量監(jiān)控提供了一種快速檢測方法。并對山西老陳醋中川芎嗪表面增強拉曼光譜檢測方法中各條件參數(shù)進行優(yōu)化，包括積分時間、積分次數(shù)、平滑系數(shù)、檢測功率、樣品量這5個指標，優(yōu)化結(jié)果為：積分時間20 s，積分次數(shù)10次，平滑系數(shù)10，功率300 mW，樣品量20 μL為本研究建立的拉曼檢測法最佳檢測條件。通過方法學評價得到此方法特異性強，準確性、精密度和重現(xiàn)性均良好。與高效液相色譜法加標回收率相當，精密度有所提高，變異系數(shù)有顯著提高，說明此方法的精密度較好。

食品安全質(zhì)量檢測越來越向無損化、簡單化、智能化方向發(fā)展[25]。本研究所建立的方法在一線檢測中適用，且已在實踐中得到了驗證。今后，還需要建立并完善數(shù)據(jù)庫，期望該方法能與相關(guān)的追溯技術(shù)[26]、大數(shù)據(jù)等相結(jié)合為食品安全保駕護航。