高鳳苑，關(guān)欣，韓良亮，覃秀英，韋東來，藍(lán)平，廖安平

(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料及改性重點實驗室，廣西高?；瘜W(xué)與 生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧，530006)

姜黃素又稱姜黃色素，是常用的天然黃色色素，有特殊芳香味道。大量文獻(xiàn)記載，姜黃素具有多種藥理作用，尤其在抗動脈硬化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。但姜黃素水溶性低，穩(wěn)定性差，經(jīng)胃腸吸收率較低，代謝快[2]，所以限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。因此，合適的姜黃素載體是提高其生物利用率的重要手段，新型姜黃素緩釋載體的研究逐漸受到重視，所涉及領(lǐng)域也日益廣泛[3]。

水凝膠作為藥物載體應(yīng)用已經(jīng)趨于廣泛，且具有良好緩釋效果。近年來，有關(guān)對姜黃素復(fù)合水凝膠的研究越來越受到重視[4]。水凝膠是高度溶脹、親水、三維聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由于存在交聯(lián)，糾纏或結(jié)晶區(qū)[1]，能吸收大量水而不溶于水。通過天然材料聚合形成的水凝膠具有生物相容性和可生物降解，是用于藥物生物材料傳遞系統(tǒng)非常重要的性質(zhì)，越來越受到研究人員的關(guān)注。水凝膠網(wǎng)絡(luò)之間存在大量空隙，姜黃素分子可以連接在網(wǎng)絡(luò)里，使釋放能力持續(xù)而高效。利用水凝膠對溫度、pH敏感的特性，可以將姜黃素運載到癌細(xì)胞等靶位點，起到定向治療疾病的作用。NAMDARI等[5]制備了姜黃素負(fù)載水凝膠復(fù)合物用于心力衰竭大鼠模型2周，結(jié)果顯示效果良好，且此載體未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。還有學(xué)者通過簡單混合和原味聚合制作出一種改良蜂蜜-姜黃素水凝膠復(fù)合海綿載體，具有良好的液體吸收能力和緩釋作用，且對糖尿病、足潰瘍有明顯適用性[6]。

木薯淀粉是一種高度可溶脹的、pH響應(yīng)和生物相容性聚合物，可用于將藥物輸送到體內(nèi)。木薯淀粉是豐富的天然聚合物，由于其來源豐富、成本低廉、無毒無害、生物降解等天然的特性，在各領(lǐng)域得到一定應(yīng)用[7]。由木薯淀粉制備的水凝膠親水性大，水溶脹度高，且三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)利于藥物輸送，所以本實驗采用木薯淀粉接枝丙烯酰胺制備水凝膠用于負(fù)載姜黃素，且具有良好的藥物緩釋效果。木薯淀粉水凝膠已成為較被重視的藥物載體，也能提高木薯淀粉及水凝膠的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯淀粉，工業(yè)級，廣西武鳴安寧淀粉有限公司；丙烯酰胺(AM)，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(NMBA)，分析純，阿達(dá)瑪斯；過硫酸鉀(KPS)，分析純，廣東市金華大化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；姜黃素，分析純，麥克林；氘代試劑，分析純，上海玉博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JHS恒速數(shù)顯控制器，杭州儀表電機(jī)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DGG-9070AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FD-1000冷凍干燥機(jī)，埃朗科技國際貿(mào)易有限公司；分析天平(BSA224S/0.000 1g)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；TG-DSC同步熱分析儀(STA449F3)，德國耐馳儀器制造有限公司；TQ2-312臺式全溫振蕩器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Cary100紫外-可見分光光度計，Agilent Technologies。

1.3 方法

1.3.1 木薯淀粉水凝膠的制備

稱取1 g木薯淀粉于100 mL蒸餾水中，溫度為75 ℃水浴糊化30 min至糊化完全，加入5 g丙烯酰胺于混合物中，用磁力攪拌器以75 ℃的溫度繼續(xù)攪拌20 min，再加入0.06 gN,N-亞甲基雙丙烯酰胺，加5 mL蒸餾水稀釋，最后將0.03 g過硫酸銨溶于5 mL蒸餾水中，加入后繼續(xù)以75 ℃溫度磁力攪拌10 min。攪拌結(jié)束后，75 ℃水浴中靜置10 min成均勻膠狀，將膠狀物倒入100 mL乙醇中，保持2 min，傾倒出乙醇，再加入100 mL新鮮乙醇，保持24 h以完成脫水，將脫水后的凝膠在50 ℃烘箱中干燥24 h，烘干后用蒸餾水浸泡24 h，再次烘干，備用[8]。

1.3.2 木薯淀粉水凝膠紅外性能表征

取1～2 mg已完全干燥的水凝膠樣品，與50～100 mg干燥的KBr粉末混合，置于瑪瑙研缽中充分研磨，將研磨好的混合物粉末放入壓模中，在10 kPa的壓力下壓制成透明薄片，放入紅外光譜儀進(jìn)行測試，在4 000～500 cm-1波長范圍內(nèi)，掃描。

1.3.3 木薯淀粉水凝膠核磁共振性能表征

取6～10 mg溶脹后的水凝膠樣品，溶于氘代試劑中，放入核磁共振儀中進(jìn)行測試。

1.3.4 木薯淀粉水凝膠X射線衍射性能表征

將完全冷凍干燥的水凝膠研磨成粉末，壓片后置于XRD中掃描得到XRD圖。

1.3.5 木薯淀粉水凝膠機(jī)械性能測試

取小塊定型的水凝膠，在蒸餾水中浸泡達(dá)到溶脹平衡后，進(jìn)行拉伸、壓縮、打結(jié)實驗。

1.3.6 姜黃素載藥性能的測定

1.3.6.1 姜黃素及PBS緩沖液最大吸收波長的測定

將姜黃素在無水乙醇中配制成一定濃度溶液，在波長200～800 nm范圍內(nèi)，用紫外-可見分光光度計進(jìn)行全波長掃描，由紫外吸收光譜圖選擇乙醇溶液中姜黃素的檢測波長。

配制pH值為7.4的PBS磷酸鹽緩沖液，即為人體組織液及血液的模擬系統(tǒng)。將姜黃素在上述緩沖液(含0.5% 吐溫-80)中配制成一定濃度溶液，在波長200～800 nm，進(jìn)行全波長掃描，以選擇PBS磷酸鹽緩沖液中姜黃素的檢測波長。

1.3.6.2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確稱取25 mg姜黃素，用無水乙醇溶解后，將姜黃素的乙醇溶液移到250 mL容量瓶中，再用無水乙醇進(jìn)行定容，得到100 μg/mL的儲備液。精密移取2、3、4、5、6 mL 100 μg/mL的儲備液，將其分別移到100 mL的容量瓶中，用無水乙醇進(jìn)行定容，即制成2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用無水己醇做空白對照液，分別在427 nm處測定其吸光度。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.3 PBS緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

精密稱取25 mg姜黃素，用乙醇溶解，轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，用1.3.6.1 PBS緩沖液定容，得到100 μg/mL的藥物溶液，精密移取2、3、4、5、6 mL的藥物溶液到100 mL容量瓶，以PBS緩沖液(pH=7.4，含0.5 %吐溫-80)定容，即制得濃度為2～6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用PBS緩沖液做空白對照，分別在427 nm處測定其吸光度。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.4 載藥性能的影響因素考察

采用吸附法測定姜黃素溶液吸附前后在427 nm處的吸光度。木薯淀粉水凝膠對姜黃素藥液的載藥量按式(1)、(2)計算，對其進(jìn)行各因素載藥性能影響研究。

(1)

(2)

式中:C0表示姜黃素初始藥液濃度，mg/L；Ct表示姜黃素t時刻的藥液濃度，mg/L；Ce表示姜黃素平衡藥液濃度，mg/L；Qt表示t時刻的載藥量，mg/g；Qe表示平衡載藥量，mg/g；V表示姜黃素藥液體積，L；m表示加入木薯淀粉水凝膠的量，g。

1.3.6.5 姜黃素釋藥性能的考察

將純姜黃素與最佳條件下負(fù)載于水凝膠中的姜黃素作為對照，分別置于含有10 mL PBS緩沖液的洗凈的透析袋中，透析外液為500 mL PBS緩沖液，37℃恒溫振蕩，設(shè)定振蕩時間分別為0.5、1、2、3、5、8、10、12、24、36、48、72 h后，分別取10 mL樣品液于比色皿中，隨后補(bǔ)充10 mL新PBS緩沖液，保持緩沖體系穩(wěn)定[9]。在最大吸收波長處測吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算藥物濃度，計算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外圖譜分析

木薯淀粉水凝膠紅外圖譜如圖1所示。

圖1 木薯淀粉水凝膠紅外圖譜Fig.1 Infrared map of tapioca starch hydrogel

由圖1可知，原淀粉在3 432 cm-1，1 640 cm-1，1 380 cm-1，1 157 cm-1，1 006 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，其中3 432 cm-1處為葡萄糖單元中-OH的伸縮振動吸收峰[10]，1 640 cm-1處為羰基C=O吸收峰，1 380 cm-1處為C—C的彎曲振動吸收峰，1 157 cm-1處為淀粉中糖苷鍵C—O—C的特征吸收峰[11]，1 006 cm-1為骨架振動峰。水凝膠除了有原淀粉本身的吸收峰外， 3 429 cm-1附近峰變寬是存在N—H對稱和不對稱寬峰，1 678 cm-1附近出現(xiàn)C—N鏈的伸縮振動峰，是酰胺特征峰[12]，說明丙烯酰胺成功嫁接到淀粉骨架上。

2.2 核磁共振圖譜分析

木薯淀粉水凝膠核磁圖譜如圖2所示。

圖2 木薯淀粉水凝膠核磁共振圖譜Fig.2 Nuclear magnetic resonance spectroscopy of tapioca starch hydrogel

由圖2可知，δ=1.27～1.80 ppm是丙烯酰胺中亞甲基上氫的位移[13]，δ=5.00～6.50 ppm是丙烯酰胺特征基團(tuán)酰胺基團(tuán)上氫的位移。核磁譜圖證明丙烯酰胺已經(jīng)成功接枝。

2.3 X射線衍射圖譜分析

木薯淀粉水凝膠X射線衍射圖譜如圖3所示。

圖3 木薯淀粉和水凝膠XRD圖Fig.3 XRD pattern of cassava starch and hydrogel

原淀粉XRD衍射圖約在15°、17°、18°、23°附近有衍射峰，這是多結(jié)晶區(qū)域，水凝膠的XRD衍射圖在20°左右，結(jié)晶進(jìn)一步減少，分子間氫鍵被破壞，說明木薯淀粉發(fā)生反應(yīng)成水凝膠后改變了原有的結(jié)晶。淀粉分子鏈上具有很多羥基，親水性很強(qiáng)，但是淀粉顆粒不溶于水，這是因為羥基之間通過氫鍵結(jié)合，顆粒中水分也參與形成氫鍵的緣故。淀粉顆粒內(nèi)部有結(jié)晶和無定形區(qū)域，后者具有較高的滲透性，化學(xué)反應(yīng)主要是發(fā)生在這個區(qū)域，反應(yīng)后的水凝膠主要為無定形，滲透性升高，溶脹性能良好[7]。

2.4 木薯淀粉水凝膠機(jī)械性能分析

水凝膠作為藥物輸送系統(tǒng)需要足夠的機(jī)械強(qiáng)度，這樣才可以承受器官收縮期間的壓力并延長藥物在人體內(nèi)滯留時間，具有較小機(jī)械強(qiáng)度的水凝膠可能經(jīng)過器官收縮導(dǎo)致碎裂[14]。傳統(tǒng)有機(jī)交聯(lián)的水凝膠力學(xué)性質(zhì)差，在較小外力或形變作用下易碎，本實驗使用丙烯酰胺接枝木薯淀粉制備的水凝膠，由圖4可知，木薯淀粉水凝膠能夠拉伸至原來的5倍甚至更長長度都不斷裂，用手指充分壓縮后能夠迅速回彈，恢復(fù)原有形狀并且還能夠保持凝膠體完整，能夠在進(jìn)行打結(jié)時凝膠樣品不發(fā)生破壞，表現(xiàn)出優(yōu)異的機(jī)械性質(zhì)[15]。

圖4 水凝膠機(jī)械性能測定Fig.4 Determination of mechanical properties of hydrogel

2.5 木薯淀粉水凝膠載藥性能分析

2.5.1 姜黃素及姜黃素-PBS緩沖液最大吸收波長測定

由圖5、圖6可知，姜黃素溶液以及姜黃素-PBS緩沖液在λ=427 nm處有最大吸收，由此可以確定姜黃素及PBS緩沖液的最大吸收波長為427 nm。

圖5 姜黃素最大吸收波長圖Fig.5 Maximum absorption wavelength of curcumin

圖6 姜黃素-PBS緩沖液最大吸收波長圖Fig.6 Maximum absorption wavelength of curcumin-PBS buffer

2.5.2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

將配制的2～6 μg/mL的姜黃素溶液，在427 nm處分別測定其吸光度，結(jié)果如圖7所示。

圖7 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.7 Curcumin standard curve

姜黃素溶液在427 nm處的回歸方程為A=0.148 39C+0.012 54(R2=0.999 8)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，姜黃素濃度在2～6 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.5.3 姜黃素-PBS緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

將配制的2～6 μg/mL的姜黃素PBS緩沖液溶液，在427 nm處分別測定其吸光度，結(jié)果如圖8所示，在427 nm處的回歸方程為A=0.141 32C+0.018 55(R2=0.999 85)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，姜黃素PBS緩沖液的濃度在2～6 μg/mL線性關(guān)系良好(圖8)。

圖8 姜黃素-PBS緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.8 Curcumin-PBS buffer standard curve

2.5.4 各因素對木薯淀粉水凝膠載藥性能的影響

2.5.4.1 時間對水凝膠載藥性能的影響

稱取0.1 g水凝膠，加入到500 mL 100 μg/mL的姜黃素藥液中，置于轉(zhuǎn)速120 r/min，35℃恒溫?fù)u床中振蕩，吸附時間分別為0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h，每次取1 mL吸附后藥液在25 mL容量瓶中用20%乙醇溶液定容，在紫外分光光度計中測其吸光度，計算其濃度及載藥量。實驗結(jié)果如圖9所示。

圖9 吸附時間對水凝膠載藥量的影響Fig.9 Effect of time on hydrogel loading

由圖9可知，初期水凝膠對藥物快速吸附，0.5 h達(dá)到最大載藥量，隨后載藥量開始降低，因為時間越長藥液中的水分進(jìn)入到水凝膠中，使得水凝膠溶脹，藥液中乙醇濃度變大會使水凝膠脫水，姜黃素脫附，載藥量降低[16]。

2.5.4.2 乙醇濃度對水凝膠載藥性能的影響

稱取0.1 g水凝膠，加入到500 mL 100 μg/mL的姜黃素藥液中，置于轉(zhuǎn)速120 r/min，35 ℃恒溫?fù)u床中振蕩吸附0.5 h，每次取1 mL吸附后藥液在25 mL容量瓶中分別用體積分?jǐn)?shù)為15%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液定容，在紫外分光光度計中測其吸光度，計算其濃度及載藥量。實驗結(jié)果如圖10所示。

圖10 乙醇濃度對水凝膠載藥量的影響Fig.10 Effect of ethanol concentration on hydrogel drμg loading

由圖10可知，溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對水凝膠負(fù)載姜黃素有較大的影響[17]。載藥量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，達(dá)到最大載藥量。乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，姜黃素不能完全溶解，載藥量較低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過20%后，載藥量逐漸下降，這是由于溶液中乙醇濃度過高，會使溶脹的水凝膠失水縮小，吸附的藥液流出，使載藥量降低，所以以體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇水溶液配制姜黃素溶液效果最佳[18-19]。

2.5.4.3 溫度對水凝膠載藥性能的影響

稱取0.1 g水凝膠，加入到500 mL 100 μg/mL的姜黃素藥液中，置于轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度分別為25、30、35、40、45 ℃恒溫?fù)u床中振蕩吸附0.5 h，每次取1 mL吸附后藥液在25 mL容量瓶中用20 %乙醇溶液定容，在紫外分光光度計中測其吸光度，計算其濃度及載藥量。實驗結(jié)果如圖11所示。

圖11 溫度對水凝膠載藥量的影響Fig.11 Effect of temperature on hydrogel loading

由圖11可知，由于吸附時間較短，溫度較低時，凝膠未能完全溶脹，不利于姜黃素的吸附，所以載藥量較低，在35 ℃時，達(dá)到最大載藥量，隨著溫度升高，姜黃素不穩(wěn)定，降解速度加快，而且水凝膠的溫度敏感特性使得高溫時水凝膠急劇收縮[20]，藥物脫附，所以水凝膠載藥量變低。

2.5.4.4 藥液初始濃度對水凝膠載藥性能的影響

分別稱取0.1 g水凝膠，加入到500 mL初始濃度為60、70、80、90、100、110 μg/mL的姜黃素藥液，用20%乙醇溶解，置于轉(zhuǎn)速120 r/min，35 ℃恒溫?fù)u床中振蕩吸附0.5 h，每次取1 mL吸附后藥液在25 mL容量瓶中分別用20%乙醇溶液定容，在紫外分光光度計中測其吸光度，計算其濃度及載藥量。實驗結(jié)果如圖12所示。

圖12 藥液初始濃度對水凝膠載藥量的影響Fig.12 Effect of initial concentration of drμg solution on drμg loading of hydrogel

由圖12可知，隨著姜黃素投藥量的增加,水凝膠的載藥量不斷增加,藥液初始濃度達(dá)到100 μg/mL時達(dá)到最大載藥量，此時藥液初始濃度達(dá)到飽和載藥量，濃度繼續(xù)增加，溶液過飽和，姜黃素溶解不完全使得載藥量反而又呈下降趨勢。所以水凝膠對姜黃素的有效吸附需要一個最佳的料藥比，藥液初始濃度過高會使其載藥量降低[21]。

2.6 釋藥性能分析

由圖13可知，純姜黃素釋藥迅速，5 h時發(fā)生突釋，釋藥率達(dá)到60%以上，8 h幾乎釋放完全，釋藥率達(dá)到99%以上。而負(fù)載于水凝膠中的姜黃素在介質(zhì)中的釋藥過程分為3個階段：(1)突釋階段。0～2 h藥物釋放非常迅速，這一階段釋放的主要是吸附在水凝膠表面的藥物[22]。(2)緩慢釋放階段。2～48 h，釋藥曲線逐漸平穩(wěn)，藥物緩慢而均勻的釋放入介質(zhì)中，釋藥量逐漸增加。(3)平衡緩釋階段。48～72 h這一階段水凝膠內(nèi)的藥物與水凝膠附近介質(zhì)內(nèi)的藥物達(dá)到吸附-解吸平衡，隨著介質(zhì)內(nèi)的藥物向介質(zhì)本體的擴(kuò)散，以及水凝膠在介質(zhì)中的溶脹、解體，有少量藥物向外釋放[23-24]，釋放速率開始變緩。最終，水凝膠內(nèi)仍保留一部分藥物，直到72 h時累計釋藥量達(dá)到80%。與純姜黃素對比，負(fù)載于水凝膠中的姜黃素釋藥呈規(guī)律性變化，所以采用水凝膠作為載體以達(dá)到藥物緩釋的效果[25]。

圖13 水凝膠藥物緩釋效果圖Fig.13 Hydrogel drμg sustained release effect diagram

3 結(jié)論

對水凝膠進(jìn)行性能研究結(jié)果表明，木薯淀粉水凝膠具有良好的力學(xué)性能，機(jī)械強(qiáng)度良好，適合作為藥物緩釋的載體材料。通過對木薯淀粉水凝膠載藥因素的考察，木薯淀粉水凝膠的載藥性能良好，最佳載藥條件為載藥時間0.5 h，乙醇濃度為20%，溫度為35 ℃，藥液初始濃度100 μg/mL，載藥量可達(dá)到100 mg/g。通過對比純姜黃素發(fā)現(xiàn)，負(fù)載于水凝膠中的姜黃素具有藥物緩釋效果，且效果良好。該研究為淀粉水凝膠載藥性能的研究提供一定的實驗依據(jù)，提高了木薯淀粉的附加值。