黃嬡，馬志強，王瑋，宋燕飛，李榮，陳強，陳祥貴，楊瀟

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

農(nóng)藥的大規(guī)模廣泛使用雖然促進了農(nóng)業(yè)的發(fā)展，但是殘留問題也造成了嚴重安全風險[1]。據(jù)統(tǒng)計，中國每年農(nóng)藥中毒人數(shù)高達上萬人，其中70%以上是有機磷農(nóng)藥中毒[2]。因此采用快速農(nóng)殘檢測方法普查食品和環(huán)境中的農(nóng)藥殘留是農(nóng)殘監(jiān)管的重要措施，而目前廣泛應用的農(nóng)殘快檢方法為酶抑制法。與傳統(tǒng)的儀器分析方法相比，該類方法具有操作簡便、成本低廉、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點[3]。在此基礎上發(fā)展起來的酶生物傳感器法則極大地提高了農(nóng)殘快檢的自動化水平[4-6]。

由于酶的活性和對農(nóng)藥的敏感度，對于酶抑制法的準確性和檢出限十分重要，因此關于酶源的篩選和酶性能的改良一直是研究的熱點。目前酶抑制法中常用酶為膽堿酶，包括乙酰膽堿酯酶(AChE，EC3.1.1.7)和丁酰膽堿酯酶(BChE，EC3.1.1.8)兩類。但是由于膽堿酶廣泛存在于動物組織中，如目前使用的AChE主要提取于電鰻及家蠅、庫蚊等敏感昆蟲頭部，BChE主要提取于馬血。然而動物酯酶來源有限，提取過程復雜，產(chǎn)量低，成本高，酶活性不穩(wěn)定。而植物酯酶具有來源廣泛、價格低廉等優(yōu)點，最近的研究表明，小麥[7-8]、大豆[9-10]和麻風樹[11]中的植物酯酶具有與AChE相似的農(nóng)藥敏感性。

豌豆(PisumsativumLinn.),又名寒豆、麥豆、雪豆等，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，作為植物酶源具有明顯成本優(yōu)勢。然而關于豌豆酯酶的制備與純化研究卻鮮有報道，豌豆酯酶的酶學特征和對農(nóng)藥的敏感性也并不明確，這極大地限制了豌豆酯酶在農(nóng)藥檢測中的應用。

本研究從豌豆中分離純化了植物酯酶，通過底物和抑制劑特異性實驗對酯酶的類型進行了鑒別。對豌豆酯酶的酶促反應條件進行了優(yōu)化，并通過有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥對豌豆酯酶的抑制實驗來評估該酶對農(nóng)藥的敏感性。本研究的結果為豌豆酯酶在農(nóng)藥檢測中的應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆由成都市農(nóng)林科學院提供，并由成都市農(nóng)林科學院作物研究所鑒定為蝶形花科植物豌豆(PisumsativumLinn.) 的種子。

α-醋酸萘酯(α-NA)、固藍B鹽、α-萘酚、S-乙酰硫膽堿碘化物(ATChI)、S-丁酰硫代膽堿碘化物(BTChI)、5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、鹽酸多奈哌齊、毒扁豆堿、磷酸雙4-硝基苯酯(BNPP)、樂果(純度≥98%)、毒死蜱(純度≥95%)、久效磷(純度≥99%)、辛硫磷(純度≥95%)、敵百蟲(純度≥99%)、殘殺威(純度≥99%)、三唑磷(純度≥98%)、氧樂果(純度≥95%)、敵敵畏(純度≥99%)、滅多威(純度≥99%)、涕滅威(純度≥99%)、克百威(純度≥99%):Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

1.3 酶活性測定

在96孔板中，加入50 μL酶液，50 μL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.5)和100 μL的α-NA(0.2 mmol/L)，混勻并在35 ℃孵育15 min。然后加入100 μL固藍B鹽溶液(2.5 g/L)，于酶標儀中在550 nm處測量吸光度[12]。1個酶活性單位(U)被定義為：在標準測定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol的酶反應產(chǎn)物α-萘酚。

1.4 酶的提取和純化

將新鮮豌豆冷凍干燥并研磨成細粉。將2.00 g豌豆粉加入20 mL的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)中。將混合物于4 ℃溫和振蕩過夜，并在4 ℃下8 000×g離心10 min，上清即為粗酶液。粗酶液再通過以下步驟進行純化：(1)在5 mL Hi-Trap SP HP柱(GE Healthcare)上進行陰離子交換層析。用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0，含有20 mmol/L NaCl)平衡后，將粗酶液上樣。用3倍柱體積的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0，含有20 mmol/L NaCl)洗柱。然后用含有NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)進行0.02～0.5 mol/L NaCl的線性梯度洗脫，洗脫液在4 ℃下用自動餾分收集器按每管2 mL收集。收集的酶液按峰合并后檢測酯酶活性，選擇酶活性高的洗脫液進行超濾濃縮。(2)在Superdex 200柱(GE Healthcare)上進行凝膠過濾層析。將濃縮的酶液上樣到預先用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)平衡的柱子上，然后用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 5.0)按0.5 mL/min的流速洗脫。洗脫液按每管1.0 mL收集，洗脫液按峰合并后檢測酯酶活性，選擇酶活性高的洗脫液冷凍干燥，儲存于-20 ℃。

1.5 酶底物和抑制劑的特異性測定

分別采用ATChI、BTChI和α-NA作為底物進行底物特異性實驗，并根據(jù)DTNB方法[13]進行以ATChI和BTChI為底物的酶活性測定。

分別用毒扁豆堿、鹽酸多奈哌齊和BNPP作為抑制劑進行酶抑制劑的特異性實驗，并通過測定酶抑制率比較酶抑制劑的特異性。

1.6 酶濃度、溫度、pH值對酶活性的影響

為了確定酶反應的最佳酶濃度、溫度和pH，分別在不同的酶質(zhì)量濃度0.25、0.35、0.45、0.70、1.40 μg/mL，溫度20、25、30、35、40、45、50 ℃和pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5下按照1.3提供方法測定酶活性。

1.7 酶動力學參數(shù)測定

為確定米氏常數(shù)Km和最大酶反應速度Vmax，分別測定底物α-NA在不同濃度(0.010、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000 mmol/L)下的酶反應速度(即單位時間內(nèi)α-萘酚的產(chǎn)生量)。實驗結果通過Origin 8.5軟件(Origin Lab)直接進行米氏方程的非線性回歸擬合，并計算Km和Vmax值。

1.8 農(nóng)藥對酶的抑制率測定

有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對植物酯酶的抑制率測定根據(jù)PRUETT等報道的方法[14]并做改進。即在96孔板中，加入50 μL不同濃度(2×10-9～2×10-3mol/L)的農(nóng)藥樣品和50 μL酶液(1 mU/mL)，混勻并在35 ℃孵育30 min，再通過1.3提供方法測定3 min的吸光度的變化。對照組在反應體系中用50 μL蒸餾水替代農(nóng)藥樣品。根據(jù)公式(1)計算抑制率：

(1)

式中：ΔA0為對照組吸光度變化;ΔA1為樣品吸光度變化。用該方法進行農(nóng)藥殘留檢測時，以抑制率≥50%作為農(nóng)藥被檢出的閾值[15]。

根據(jù)不同農(nóng)藥濃度對酶的抑制率，參照何紹志等[16]報道的方法，擬合酶抑制曲線方程，計算抑制率為50%時的農(nóng)藥濃度，即為該農(nóng)藥對酶的IC50值。再根據(jù)下式計算該酶應用于酶抑制法檢測該農(nóng)藥的檢出限(LOD),如公式(2)所示。

(2)

式中：IC50為該農(nóng)藥對豌豆酯酶的IC50值(mol/L);M為該溶液的摩爾質(zhì)量(g/mol);0.5為根據(jù)國標方法[17]有機提取液揮干后用加入0.5 mL緩沖液定容;2為果蔬樣品2.00 g;1 000為1 g等于1 000 mg。

1.9 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以3個獨立樣本(n=3)的(x±SEM表示。采用SPSS 22.0 軟件(IBM)進行統(tǒng)計分析，兩組之間數(shù)據(jù)使用Student′st檢驗進行比較，多組數(shù)據(jù)通過單因素方差分析后，再使用Duncan檢驗進行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 豌豆酯酶的純化

目前已有不同來源的植物酯酶通過如離子交換層析和凝膠層析等方法被純化和表征(包括小米[18]、擬南芥[19]、麻瘋樹[11]、燕麥[20]、蘋果[21]和西葫蘆[22])。但不同來源的植物酯酶其性質(zhì)也不盡相同。

本研究主要通過Hi-Trap SP HP柱的陽離子交換層析和Superdex 200柱的凝膠過濾層析對豌豆酯酶進行純化，表現(xiàn)出較好的純化效果。表1中給出了每個純化階段的回收率、純化倍數(shù)和比酶活性。從中可知豌豆酯酶的最終純化倍數(shù)達41倍，回收率為21.6%，比酶活性為0.695 U/mg。從陽離子交換層析的洗脫圖(圖1-A)可知，有2個蛋白峰被洗脫，峰I具有較高的酯酶活性(圖1-C)。收集峰I流分進行凝膠過濾層析，有5個蛋白質(zhì)峰被洗脫(圖1-B)，其中峰Ⅶ具有最高的酯酶活性(圖1-C)。通過SDS-PAGE確認純化所得的豌豆酯酶的分子質(zhì)量和純度(圖1-D)可知，純化的豌豆酯酶為單一條帶。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物酯酶具有低分子質(zhì)量，并含有單一的多肽鏈，分子質(zhì)量范圍為20～60 kDa[23-25]。從SDS-PAGE中發(fā)現(xiàn)，豌豆酯酶的分子量約為26.0 kDa。

表1 豌豆酯酶純化效果Table 1 Purification of esterases from pea

A-Hi-Trap SP HP離子交換色譜的洗脫圖譜; B-Superdex 200凝膠過濾層析的洗脫圖譜;C-通過離子交換層析和凝膠過濾層析洗脫峰的酯酶活性; D-酯酶粗酶和純化酶的SDS-PAGE圖1 豌豆酯酶的純化和SDS-PAGEFig.1 Purification and SDS-PAGE of pea esterase注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P <0.05。

2.2 豌豆酯酶的分類

酯酶分為羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)，芳基酯酶(EC 3.1.1.2)，乙酰酯酶(EC 3.1.1.6)和膽堿酯酶(乙酰膽堿酯酶，EC 3.1.1.7和丁酰膽堿酯酶，EC 3.1.1.8)。其中只有羧酸酯酶和膽堿酯酶可被有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥抑制，可用于農(nóng)藥檢測。

豌豆酯酶的底物特異性實驗發(fā)現(xiàn)，底物的活性按α-NA> ATChI> BTChI的順序降低，且后兩者底物幾乎無酶活性(圖2-A)。因此豌豆酯酶更像羧酸酯酶。在其他豆類[26]、麻風樹種子[11]和小米[18]酯酶的底物特異性研究中使用的苯基酯，甘油酯和萘基酯的實驗結果也顯示，這些酯酶通常優(yōu)先水解短鏈酯。這一特異性對植物生長和發(fā)育過程中短鏈脂肪酸酯的水解可能具有重要作用[27]。

A-對不同底物豌豆酯酶的活性；B-不同抑制劑對豌豆酯酶的抑制率圖2 豌豆酯酶鑒定Fig.2 Classification of pea esterase注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P<0.05。

為了進一步確認豌豆酯酶的類型，分別采用酯酶廣譜抑制劑毒扁豆堿，乙酰膽堿酯酶特異抑制劑鹽酸多奈哌齊和羧酸酯酶抑制劑BNPP進行酶抑制實驗。酶抑制率按BNPP>毒扁豆堿>鹽酸多奈哌齊順序遞減，BNPP抑制率顯著高于后兩者(圖2-B)。由于BNPP已被證明是淡色庫蚊[28]和大鼠[23]中的羧酸酯酶特異性抑制劑。因此豌豆酶可被BNPP抑制，卻不能被鹽酸多奈哌齊[29]抑制的結果，進一步證明了豌豆酯酶可能屬于羧酸酯酶類。

2.3 酶質(zhì)量濃度、pH和溫度對酶活性的影響和酶動力學參數(shù)測定

從酶濃度實驗可知酶濃度對酶促反應有顯著影響(圖3-A)。隨著酶質(zhì)量濃度的增加，550 nm的吸光度值也增大，呈現(xiàn)濃度依賴性。然而，根據(jù)朗伯比爾定律，測定底物濃度的線性范圍在吸光度0.2～0.8，所以0.45 μg/mL為最佳酶質(zhì)量濃度。

A-不同酶濃度下的酶反應的吸光度；B-不同溫度下的豌豆酯酶活性；C-不同pH值的豌豆酯酶活性；D-以α-NA為底物的豌豆酯酶的米氏方程非線性回歸曲線圖3 酶質(zhì)量濃度、pH和溫度對酶活性的影響和酶動力學參數(shù)測定Fig.3 Effects of enzyme concentration, pH and temperature on enzyme activity and enzyme kinetics注：數(shù)據(jù)以表示，用不同字母表示各組差異顯著，P<0.05。

為了優(yōu)化反應溫度，在20～50 ℃測定酶活性。隨著溫度的升高，酶促反應加速，使酶活性升高，但在高溫下酶活可能由于蛋白質(zhì)變性而受到抑制，該酶的最適反應溫度為40 ℃(圖3-B)。其他植物酯酶如來源于小米[18]、大戟科植物[25]和西葫蘆[22]的酯酶的最適溫度也在上述范圍內(nèi)。

pH值也可以顯著影響酶活性，每種酶都具有最適的pH范圍。在植物酯酶中，小麥[7-8]的最適pH為6.5，黧豆屬種子[24]的最佳pH為7.0，小米[18]和大戟科植物[25]的最適pH為7.5。豌豆酯酶在5.5～7.5的pH范圍內(nèi)均顯示出活性，但在pH 6.5時觀察到最大的酶活性(圖3-C)。

米氏常數(shù)Km值可近似表征酶與底物的親和力。根據(jù)米氏方程進行非線性回歸(圖3-D)確定了豌豆酯酶作用于α-NA的Km和Vmax值分別為0.119 mmol/L和9.23 μmol/min。

2.4 豌豆酯酶粗酶和純化酶的對農(nóng)藥的敏感性

根據(jù)酯酶與農(nóng)藥的相互作用，一般將酯酶分為3種類型，A型酯酶不受有機磷農(nóng)藥抑制，卻能水解有機磷農(nóng)藥，C型酯酶不水解有機磷農(nóng)藥，也不被有機磷農(nóng)藥抑制[30]。只有B型酯酶很容易被有機磷農(nóng)藥抑制，可用于農(nóng)藥檢測。

為了解豌豆酯酶對農(nóng)藥的敏感性，對不同濃度(2×10-9～2×10-3mol/L)的8種有機磷農(nóng)藥和4種氨基甲酸酯農(nóng)藥進行酶抑制率測定。當使用酶抑制法檢測農(nóng)藥時，通常以酶抑制率大于或等于50%作為樣品中農(nóng)藥被檢出的閾值。因此，可以使用IC50值來計算豌豆酯酶用于農(nóng)殘檢測的LOD值。表2中列出了豌豆酯酶粗酶和純化酶的對不同農(nóng)藥的IC50值和LOD值，并將其與不同農(nóng)藥的最大殘留限量值(MRL)[31]進行比較。

從表2中可知，純化后的豌豆酯酶IC50值均小于粗酶，這意味著對農(nóng)藥的檢測靈敏度顯著提高。通過純化使得豌豆酯酶對一些農(nóng)藥的檢出限達到MRL。然而，仍有2種有機磷農(nóng)藥(久效磷，毒死蜱)的檢出限高于其MRL，說明豌豆酯酶對不同類型農(nóng)藥的敏感性差異較大。該結果表明，豌豆酯酶(B型酯酶)可以代替AChE用于酶抑制法檢測有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥。

3 結論

本研究從豌豆中提取的植物酯酶通過陽離子交換層析和凝膠過濾層析被純化。通過底物和抑制劑特異性實驗將豌豆酯酶鑒定為羧酸酯酶。豌豆酯酶在酶濃度為0.45 μg/mL，緩沖液pH 6.5和反應溫度40 ℃時，具有最好的催化活性。有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥可抑制豌豆酯酶活性。這表明豌豆酯酶屬于B型酯酶，因此可以代替AChE，用于酶抑制法檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。經(jīng)過純化的豌豆酯酶通過酶抑制法檢測農(nóng)藥的LOD值顯著低于粗酶，滿足大多數(shù)農(nóng)藥MRL檢測的要求。