徐富成，吳傳超，顧秋亞，李國(guó)瑩，周劍麗，余曉斌

(工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214112)

姜黃素類化合物主要包括姜黃素、單脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素，其中以姜黃素為主要成分[1]，主要存在于植物姜黃、莪術(shù)和郁金的根或莖中，長(zhǎng)期以來(lái)就作為一種常用的天然色素被廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中[2]。研究表明姜黃素可抑制眾多腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，能影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)和步驟，近兩年研究表明，姜黃素具有提高記憶力、抗老年癡呆活性，對(duì)急性、亞急性和慢性炎癥均具有抗炎作用[3-6]，對(duì)肝臟有保護(hù)功能[7]，因此它亦具有廣泛的醫(yī)用價(jià)值。

然而，姜黃素的應(yīng)用受限于它的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性、低的生物利用度和差的水溶性[8-11]，姜黃素有烯醇式(圖1-A)和酮式(圖1-B)兩種結(jié)構(gòu)。姜黃素在水中幾乎不溶解，能溶于堿性溶液和乙醇、丙酮、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑[12]。因此，提高姜黃素的水溶性和生物利用度十分必要。目前提高姜黃素的水溶性的一般方法有環(huán)糊精包被、添加乳化劑、連接親水基團(tuán)、形成綴合物、糖苷化等[13-18]。其中，糖苷化是提高天然產(chǎn)物水溶性的一種有效途徑[19]。CHOUDHURY等通過(guò)化學(xué)法制備了姜黃素葡萄糖苷和姜黃素雙葡萄糖苷[20]；ZHANG等[21]利用華根霉合成了姜黃素葡萄糖苷；PRASAD等[22]利用苦杏仁中的β-葡萄糖苷酶合成了姜黃素雙葡萄糖苷，有效提高了姜黃素的水溶性和生物利用度，其抗氧化活性、抑菌活性均有所提高。

本文成功篩選到1株乳酸菌能夠有效地將葡萄糖苷連接到姜黃素分子的羥基集團(tuán)上。研究通過(guò)LC-MS確認(rèn)了糖苷化產(chǎn)物。

A-烯醇式姜黃素；B-酮式姜黃素圖1 姜黃素分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Chemical structure of curcumin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室菌株保藏庫(kù)。

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、K2HPO4、乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、葡萄糖、檸檬酸二銨、吐溫80、瓊脂、無(wú)水乙醇(AR)、乙酸乙酯(AR)上海國(guó)藥集團(tuán)；甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)，阿拉丁試劑有限(中國(guó))公司。

G180T滅菌鍋，美國(guó)致微儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；cence H180型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)沃特世公司。

1.2 菌種篩選

通過(guò)顏色圈法篩選出能夠產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌和乳酸菌，篩選方法如下：在YPD和MRS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的梔子苷和0.25%的谷氨酸鈉。如篩選平板變藍(lán)，則說(shuō)明其是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株[23]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

種子培養(yǎng)基：每100 mL種子液加入蛋白胨 1 g、牛肉膏 1 g、酵母粉0.5 g、K2HPO40.2 g、乙酸鈉 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.08 g、MnSO4·4H2O 0.02 g、葡萄糖 2 g、檸檬酸二銨 0.2 g、吐溫 80 0.5 mL、瓊脂 2 g(固體培養(yǎng)基)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：每100 mL發(fā)酵液加入蛋白胨 0.5 g、酵母粉 0.25 g、K2HPO40.2 g、乙酸鈉 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.08 g、MnSO4·4H2O 0.02 g、葡萄糖 4 g、檸檬酸二銨 0.2 g。

以上培養(yǎng)基分裝封口后于滅菌鍋115 ℃下滅菌30 min。

種子液培養(yǎng)：將乳酸菌接種于250 mL三角瓶中，每瓶裝100 mL上述MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液培養(yǎng)：配制80 mL上述MRS發(fā)酵培養(yǎng)基于250 mL三角瓶中，于滅菌鍋115 ℃下滅菌30 min，接種量為10 mL，再加入10 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的乙醇姜黃素溶液，于37 ℃ 60 r/min搖床培養(yǎng)4 d。

1.3.2 姜黃素及其衍生物的提取

將發(fā)酵4 d的發(fā)酵液按10 000 r/min離心10 min，取上清液。上清液用乙酸乙酯萃取3次，V(上清液)∶V(乙酸乙酯)=2∶1，合并乙酸乙酯層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，加入10 mL甲醇(HPLC)復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜備用。

1.3.3 姜黃素及其衍生物的檢測(cè)方法

使用高效液相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，液相條件為：ZORBOX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；VWD檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)425 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速為1 mL/min；流動(dòng)相純水(A)-乙腈(B)，洗脫梯度如表1。

表1 HPLC流動(dòng)相梯度Table 1 The gradient elution program of HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種選擇

通過(guò)選擇顏色圈變藍(lán)的能夠產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在姜黃素的特征吸收波長(zhǎng)下有新的產(chǎn)物產(chǎn)生，說(shuō)明該菌株具有轉(zhuǎn)化能力，結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果分析，最終確定實(shí)驗(yàn)菌株。

圖2 顏色圈篩選平板Fig.2 Color circle screening plate

在MRS平板上37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)：大小中等，凸起，微白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊，呈圓形。

菌株經(jīng)上海生物工程股份有限公司測(cè)序，利用BLAST程序?qū)λ鶞y(cè)菌種16S rDNA測(cè)序結(jié)果比對(duì)，并用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。用鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行發(fā)育樹分析。由圖3可知，該菌株為L(zhǎng)actobacilluszeaestrain OZK17。

圖3 Lactobacillus zeae strain OZK17 菌株進(jìn)化樹圖Fig.3 Lactobacillus zeae strain OZK17 strain evolution tree

2.2 HPLC檢測(cè)分析

樣品經(jīng)HPLC在姜黃素特征吸收波長(zhǎng)425 nm下檢測(cè)如圖4所示，圖4-A為姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測(cè)圖譜，圖4-B中保留時(shí)間為9.696 min和7.402 min的未知產(chǎn)物1和2出峰比姜黃素早，其在高水相時(shí)洗脫出來(lái)，說(shuō)明其具有比姜黃素更大的極性，初步推測(cè)其為比姜黃素水溶性更好的衍生物。

A-姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜；B-轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物HPLC圖譜圖4 HPLC分析圖譜Fig.4 HPLC analysis chromatograms

2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC-MS定性分析

對(duì)未知產(chǎn)物1進(jìn)行ESIMS分析，由圖5-A可知，其MS1出現(xiàn)m/z529的[M-H]-和m/z565的[M+Cl]-的分子離子峰，也出現(xiàn)m/z367的[M-H]-的姜黃素分子離子峰，初步判斷為連上162 Da(六碳糖)產(chǎn)生的姜黃素葡萄糖苷。

由圖5-B和圖5-C可知，未知峰MS2圖出現(xiàn)的離子碎片m/z134、149、173、175和217均為姜黃素MS2離子碎片特征離子峰，其斷裂方式如圖6所示。此外，由圖9可知，未知產(chǎn)物的最大紫外吸收波長(zhǎng)和姜黃素分子的最大紫外吸收波長(zhǎng)基本一致。綜合以上檢測(cè)結(jié)果，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為姜黃素葡萄糖苷。

對(duì)未知產(chǎn)物2進(jìn)行ESIMS分析，由圖7-A可知，其MS1出現(xiàn)m/z691的[M-H]-，初步判斷為連上2個(gè)162 Da(六碳糖)產(chǎn)生的姜黃素葡萄糖苷。

由圖7-B和圖5-C可知，未知峰MS2圖出現(xiàn)的離子碎片m/z175、217、367、均為姜黃素MS2離子碎片特征離子峰，碎片m/z409、541為姜黃素葡萄糖苷MS2離子碎片特征離子峰，其斷裂方式如圖8所示。

A-姜黃素葡萄糖苷分子的MS圖；B-姜黃素葡糖糖苷對(duì)應(yīng)峰的MS2圖；C-姜黃素對(duì)應(yīng)峰的MS2圖圖5 質(zhì)譜分析圖譜Fig.5 Mass spectrometry analysis

圖6 姜黃素葡萄糖苷斷裂方式Fig.6 Curcumin glucoside breaks

A-姜黃素雙葡萄糖苷分子的MS1圖；B-姜黃素雙葡萄糖苷分子的MS2圖圖7 質(zhì)譜分析圖譜Fig.7 Mass spectrometry analysis

圖8 姜黃素雙葡萄糖苷斷裂方式Fig.8 Curcumin-bis-glucoside breaks

此外，由圖9可知，未知產(chǎn)物的最大紫外吸收波長(zhǎng)和姜黃素分子的最大紫外吸收波長(zhǎng)基本一致。綜合以上檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為姜黃素雙葡萄糖苷。

A-姜黃素UV-Max圖譜；B-姜黃素葡萄糖苷UV-Max圖譜；C-姜黃素雙葡萄糖苷UV-Max圖譜圖9 UV-Max圖譜Fig.9 UV-Max map

2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物水溶性驗(yàn)證

上述樣品經(jīng)半制備液相分離出單個(gè)峰，旋干，加超純水復(fù)溶，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按上述方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖10所示，在保留時(shí)間為9.631和7.333 min處檢測(cè)出吸收峰，為姜黃素葡萄糖苷和姜黃素雙葡萄糖苷，而姜黃素溶解于水中其色譜無(wú)響應(yīng)，由此證明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物水溶性遠(yuǎn)高于姜黃素。

A-姜黃素葡萄糖苷HPLC圖譜；B-姜黃素雙葡萄糖苷HPLC圖譜圖10 HPLC檢測(cè)圖譜Fig.10 HPLC detection chromatograms

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)旨在提高姜黃素的水溶性。糖苷化已經(jīng)成為增加天然產(chǎn)物水溶性的有效途徑[24]，HOLDER等報(bào)道，姜黃素在大鼠體內(nèi)主要代謝物為四氫姜黃素和六氫姜黃素的葡萄糖苷酸[25]，ZENG等利用真菌菌株BeauveriabassianaATCC 7159的生物轉(zhuǎn)化成功合成了1種新的姜黃素衍生物——姜黃素-8′-O-4″-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷，新化合物水溶性比姜黃素高39 000倍[26]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)顏色圈法篩選出具有轉(zhuǎn)化作用的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌L.zeaestrain OZK17，利用糖苷水解酶的逆反應(yīng)將葡萄糖分子連接到姜黃素分子上形成姜黃素葡萄糖苷，通過(guò)HPLC初步確認(rèn)了未知新物質(zhì)，經(jīng)LC-MS確定了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為姜黃素葡萄糖苷和姜黃素雙葡萄糖苷。ZHANG等利用華根霉合成的姜黃素葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到57%[8]，本研究中姜黃素葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率為40%左右(以峰面積計(jì)算)，而姜黃素雙葡萄糖苷未見其報(bào)道，本研究中姜黃素雙葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率為4%，整體轉(zhuǎn)化率有待進(jìn)一步提高。

本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)乳酸菌L.zeaestrain OZK17在無(wú)氧環(huán)境下對(duì)姜黃素不轉(zhuǎn)化、對(duì)于無(wú)乙醇和加吐溫80溶解姜黃素的情況均不轉(zhuǎn)化，推測(cè)其為好氧反應(yīng)，乙醇為其反應(yīng)的催化劑。

微生物發(fā)酵法制備水溶性姜黃素有著化學(xué)法所不具備的成本低、污染小和反應(yīng)溫和的優(yōu)勢(shì)，尤其是益生菌發(fā)酵，更是為姜黃素在今后食品、藥品上更充分和有效的利用提供了一種新的參考。