于慧前 杜強(qiáng) 李華偉 李慶忠 *

1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科研究院，耳鼻喉科耳科中心（上海200031）

2國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)聽覺(jué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

成骨不全(osteogenesis imperfect,OI)是一組以骨折和骨畸形為主要臨床表現(xiàn)的常染色體顯性遺傳性疾病，也可伴有耳聾、藍(lán)鞏膜、牙齒發(fā)育不全、身材矮小、關(guān)節(jié)松弛以及脫發(fā)等癥狀[1,2]。其中耳聾一般表現(xiàn)為漸進(jìn)性聽力下降，聽力學(xué)檢查以傳導(dǎo)性聾或混合性耳聾為主[3]。從病因和臨床表現(xiàn)的關(guān)系來(lái)說(shuō)，該遺傳性疾病致成骨不全/耳硬化癥等的主要病因均為間充質(zhì)組織發(fā)育不全和膠原合成障礙[4]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于遺傳性成骨不全/耳硬化的機(jī)制及其相關(guān)性的研究較少，本病尚缺乏病理診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，主要根據(jù)家族史、遺傳史和特異性體征進(jìn)行臨床診斷與分型，即Sillence I—IV型。目前，對(duì)其導(dǎo)致的耳聾除了聽力增補(bǔ)治療外，尚無(wú)其他具體有效方法。因此，深入全面地了解本病具有非常重要的意義。本研究對(duì)一個(gè)臨床表現(xiàn)疑似為成骨不全/耳硬化的中國(guó)漢族家系的臨床檢查、基因突變方面進(jìn)行了研究和總結(jié)。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象及家系資料采集

該家系成員來(lái)自中國(guó)江蘇省，家系成員包括5代共18人，6人已故。所有健在的家族成員進(jìn)行了詳細(xì)的病史采集，所有的可疑患者均進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查，包括耳科?？茩z查，身高、上肢骨X光片、聽力、眼睛鞏膜和牙齒等。通過(guò)詳細(xì)問(wèn)診確定其他家系成員是否為患者并進(jìn)行臨床分型。采集先證者、隨診家屬外周靜脈血，對(duì)照為我院分子遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)中50名正常對(duì)照者的靜脈血樣本，所有成年研究對(duì)象均簽署了知情同意書，未成年由其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 DNA提取和基因測(cè)序

本項(xiàng)目組篩選了先證者、先證者之子、先證者之父、先證者之母四名人員進(jìn)行了檢測(cè)。抽取受調(diào)查者外周靜脈血3～5mL，EDTA抗凝，參照試劑盒說(shuō)明抽提DNA（Qiagen公司基因組DNA提取試劑盒）。然后對(duì)DNA進(jìn)行定量和純度檢測(cè)（NanNo-1000,USA），-80℃保存。對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化并檢測(cè)純度后，送我院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行成骨不全相關(guān)基因檢測(cè)。利用液相捕獲技術(shù)將樣本的目標(biāo)基因捕獲出來(lái)，然后利用新一代測(cè)序儀illumina HiSeq 2000進(jìn)行高通量測(cè)序，平均深度不小于200X。

1.3 基因分析

將測(cè)序結(jié)果與Human Gene Mutation Database(HG19)、Locus Specific Mutation Database(http://www.hgvs.org/dblist/glsdb.htm)、dbSNP（v144）、美國(guó)國(guó)家生物信息學(xué)中心、SPIDEX數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，采用Netgene2 Server等軟件對(duì)剪接突變等潛在致病位點(diǎn)進(jìn)行分析并檢測(cè)其致病性。

2 結(jié)果

2.1 先證者臨床表現(xiàn)

先證者(IVb)，女性，34歲，漢族，來(lái)自江蘇省。其父母否認(rèn)近親婚配。因聽力漸進(jìn)性下降5年就診。既往無(wú)中耳炎病史，無(wú)耳毒性藥物使用史，無(wú)噪音接觸史。

臨床檢查：先證者身高160cm，藍(lán)色鞏膜，牙列不齊，視力無(wú)明顯異常，雙側(cè)鼓膜完整，音叉Rinne試驗(yàn)256、512 Hz均為陰性，Weber試驗(yàn)偏向耳聾較重側(cè)，Schwabach試驗(yàn)骨導(dǎo)延長(zhǎng)，Gelle試驗(yàn)陰性，提示鐙骨底板固定。聽力純音測(cè)聽為雙側(cè)傳導(dǎo)性耳聾。聲導(dǎo)抗和耳CT未見明顯異常，青少年時(shí)期上肢骨折史（圖1）。臨床診斷為I型成骨不全。

圖1 先證者的基本臨床表現(xiàn)(A)雙眼表現(xiàn)為藍(lán)色鞏膜；(B)雙眼B超未見明顯異常；(C)電測(cè)聽提示雙耳傳導(dǎo)性聽力下降；(D)聲導(dǎo)抗提示雙耳“A”型；(E)顳骨CT未見明顯異常；(F)x光檢查結(jié)果提示尺骨骨折Fig.1 The audiological and physical examination of the probands(A)blue sclera;(B)no obvious abnormality by ultrasonography;(C)Binaural conductive hearing by PTA;(D)"A"type by acoustic immittance measurement;(E)the temporal bone CT;(F)the fracture of ulna by X-ray examination

2.2 家系分析

家系中5例患者均有藍(lán)色鞏膜，先證者、其母親和兒子均曾因輕微外傷發(fā)生骨折1～3次，先證者和母親均有聽力下降，先證者母親(IIIa)為混合型聽力損失，聽力損失從50多歲開始出現(xiàn)，既往無(wú)中耳炎發(fā)作病史，無(wú)耳毒性藥物使用史，無(wú)噪音接觸史；先證者兒子(Va)目前8歲，無(wú)明顯聽力下降，純音測(cè)聽結(jié)果和聲導(dǎo)抗結(jié)果均正常。家系患者身高基本正常，肢體未見畸形，行走功能正常。家族中無(wú)其他遺傳病史。家系調(diào)查顯示，先證者之母、祖父、曾祖母及先證者的兒子均患有或可疑I型OI。家系具有常染色體顯性遺傳特征(表1，圖2)

圖2 I型成骨不全/耳硬化癥(COL1A1基因突變)家系圖譜，其中箭頭指示先證者Fig.2 The pedigree charts for type I osteogenesis imperfecta/otosclerosis,and the arrow indicates the proband

2.3 遺傳學(xué)檢查

根據(jù)臨床變現(xiàn)和基因型比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MYH14基因雜合突變，即c.5186_5188del(缺失)，導(dǎo)致氨基酸改變p.1729_1730del(缺失)。TBC1D24基因雜合突變，即：c.439G＞A(編碼區(qū)第439號(hào)核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤)，導(dǎo)致氨基酸改變p.D147N(第147號(hào)氨基酸由天冬氨酸變異為天冬酰胺)，為錯(cuò)義突變。以上兩個(gè)位點(diǎn)臨床意義未明，結(jié)合臨床表現(xiàn)，排除其為致病突變可能。

DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，先證者COL1A1基因中c.3540delC(胞嘧啶缺失)，導(dǎo)致氨基酸改變，即p.G1181Afs*58（移碼突變），家庭成員中先證者的母親和兒子也存在該基因突變位點(diǎn)，該家系中1例健康人（先證者的父親未攜帶此變異）。所有檢測(cè)對(duì)象COL1A2、PPIB、SERPINF1、IFITM5、CRTAP、SERPINH1等基因的外顯子編碼區(qū)均未見異常。為了驗(yàn)證該位點(diǎn)是造成OI的致病突變位點(diǎn)或者多態(tài)性改變，我們?cè)谥袊?guó)聽力正常人群中進(jìn)行COL1A1基因突變篩查，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)存在于50例正常人群中。因此，c.3540delC變異不屬于多態(tài)性位點(diǎn)，綜合考慮該位點(diǎn)為致病性變異（圖3）。

圖3 A先證者的COL1A1外顯子48測(cè)序結(jié)果；B先證者之子的COL1A1外顯子48測(cè)序結(jié)果；C先證者之母的COL1A1外顯子48測(cè)序結(jié)果；D先證者之父的COL1A1外顯子48測(cè)序結(jié)果。先證者、先證者之子和先證者之母均出現(xiàn)了c.3540delC雜合突變，其中紅色箭頭表示突變位點(diǎn)。Fig.3(A)sequencing results of COL1A1 gene exon 48 of the proband;(B)sequencing results of COL1A1 gene exon 48 of the proband's son;(C)sequencing results of COL1A1 gene exon 48 of the proband's mother;(D)sequencing of COL1A1 gene exon 48 of the proband's father.c.3540delC heterozygous mutations occurred in probands,probands'son and probands'mothers,with the arrow indicating the mutation site.

表1家系成員基本資料和聽力情況Table 1 The physical examination and audiological test of family members

2.4 COL1A1突變位點(diǎn)和臨床表型分析

我們通過(guò)檢索中文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)和pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)，找出中國(guó)人群COL1A1基因突變的相關(guān)文獻(xiàn)。表2列出了目前已報(bào)道的中國(guó)COL1A1突變位點(diǎn)和臨床表型[5-25]。結(jié)果顯示，COL1A1突變的位點(diǎn)多變，即使同一突變位點(diǎn)，臨床特征也表現(xiàn)各異，其中藍(lán)色鞏膜發(fā)生率最高，其次是多發(fā)性骨折史，聽力下降的發(fā)生率最低?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)，本家系的位于第48外顯子的3540delC突變位點(diǎn)雖然在國(guó)外文獻(xiàn)中已有個(gè)例報(bào)道，但在中國(guó)人群中尚無(wú)報(bào)道。另外，這個(gè)家系中受累個(gè)體的臨床特點(diǎn)是高度異質(zhì)性的。

3 討論

成骨不全（OMIM:166200）是一種遺傳性異質(zhì)性結(jié)締組織疾病，其主要特征是骨含量低、骨質(zhì)脆、創(chuàng)傷后易骨折等。疾病嚴(yán)重程度從輕度的不易骨折到重度的子宮內(nèi)骨折和/或圍產(chǎn)期致死等[1,2]。骨外表現(xiàn)保護(hù)牙齒發(fā)育不全、聽力減退/喪失和藍(lán)色鞏膜等，不同程度上影響著患者的生活質(zhì)量。Sillence等根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)特征將成骨不全不同類型；其中，I-IV型一般是由COL1A1／COL1A2基因突變引的常染色體顯性遺傳性疾病[26]。本研究中進(jìn)一步的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該患者及其患病家庭成員均攜帶有相同的COL1A1基因突變，臨床診斷均為I型成骨不全，家系患者均有藍(lán)色鞏膜，骨折次數(shù)0～3次，家系患者中部分有聽力障礙，身高基本正常，沒(méi)有發(fā)生明顯的畸形，該家系患者的整體臨床表型較輕。

表2已報(bào)道的中國(guó)COL1A1突變位點(diǎn)和臨床表型Table 2 The mutation and clinical phenotypes of COL1A1 in Chinese family

已報(bào)道的中國(guó)COL1A1突變位點(diǎn)和臨床表型的結(jié)果顯示，COL1A1的多樣性體現(xiàn)在突變的位點(diǎn)多樣性，臨床變現(xiàn)的多樣性以及病程和預(yù)后的多樣性等。理想的基因型-表型關(guān)系分析是基于大樣本的攜帶同一突變位點(diǎn)的無(wú)關(guān)患者分析，但由于基因突變的多樣性，同一個(gè)基因突變位點(diǎn)的攜帶者樣本病例數(shù)較少，突變位點(diǎn)和臨床表型的關(guān)系難以確定，這需要我們對(duì)突變基因?qū)δ芪稽c(diǎn)的影響和氨基酸改變的效應(yīng)有更深入的認(rèn)識(shí)。

耳硬化癥是耳科的重要疾病之一，嚴(yán)重影響患者的聽力情況和生活質(zhì)量[27]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1基因也被認(rèn)為是一種與耳硬化癥遺傳有關(guān)的基因。COL1A1變異可以導(dǎo)致I型膠原合成減少引起成骨不全，骨質(zhì)疏松，局部I型膠原合成減少對(duì)聽小骨的破壞可能也是導(dǎo)致耳硬化癥的病理學(xué)改變。McKenna等研究發(fā)現(xiàn)COL1A1基因第一個(gè)內(nèi)含子中131糖蛋白(SP1)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性可能與耳硬化癥的發(fā)生相關(guān)，提出了耳硬化癥與骨質(zhì)疏松癥有相同的遺傳因素[28]。Chen W等通過(guò)病例對(duì)照研究，也證實(shí)COL1A1三聚體的增加可能參與耳硬化癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但他們也指出耳硬化癥的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，單個(gè)COL1A1的多態(tài)性改變并非導(dǎo)致耳硬化的唯一因素，可能需要篩選多個(gè)候選基因，研究其相互作用[29]。袁慧軍等通過(guò)家系研究發(fā)現(xiàn)Van der Hoeve綜合征中的COL1A1突變分別是位于外顯子26的c.1792C＞T突變和外顯子43的c.3076C＞T突變，這可能與成骨不全，藍(lán)鞏膜以及傳導(dǎo)性耳聾的發(fā)生相關(guān)[18]。多項(xiàng)研究顯示，成骨不全的受試者的大量樣本中，COL1A1基因突變的性質(zhì)與臨床表型、聽力損失的嚴(yán)重程度沒(méi)有明顯的相關(guān)性。本家系中的先征者聽力呈現(xiàn)典型的傳導(dǎo)性耳聾和鐙骨底板固定，提示耳硬化與COL1A1基因可能相關(guān)。另外，MYH14基因和TBC1D24基因的雜合突變是否參與了耳硬化的發(fā)生尚不明確。

由于成骨不全/耳硬化為基因突變導(dǎo)致的疾病，尚無(wú)針對(duì)病因的特效的治療方案和手段。目前治療主要為以預(yù)防骨折和糾正聽力等對(duì)癥治療為主，以雙膦酸鹽、鈣劑、生長(zhǎng)激素等藥物治療和外科康復(fù)干預(yù)為輔的綜合治療。另外，核因子κB配體抑制劑、Dickkopf-1抗體和硬化蛋白抗體等生物治療方法可能成為成骨不全的潛在治療手段，具體機(jī)制可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路，從而增加成骨細(xì)胞活性和促進(jìn)骨膜形成等[30,31]。本例患者針對(duì)膠原合成減少導(dǎo)致的耳硬化，臨床治療給予人工鐙骨手術(shù)或者助聽器等手段來(lái)改善患者聽力。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)臨床表現(xiàn)疑似的女性患者及其家族成員進(jìn)行新一代高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一個(gè)移碼突變，確診了該患者的突變位點(diǎn)。該家系可能為與COL1A1基因相關(guān)的非綜合征型、常染色體顯性遺傳，對(duì)理解Ⅰ型成骨不全/耳硬化癥的致病特點(diǎn)和臨床特征具有一定意義。