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        水楊酸鹽誘發(fā)大鼠聽皮層中TNF-α和GluA1表達的改變

        2019-06-26 02:36:08李雅蘭李婷王采集葛佳麗肖倩文左健趙澤祺雷冠雄張世麗喬月華
        中華耳科學雜志 2019年3期
        關(guān)鍵詞:膜蛋白水楊酸皮層

        李雅蘭李婷王采集,葛佳麗肖倩文左健趙澤祺雷冠雄張世麗喬月華,*

        1徐州醫(yī)科大學(江蘇221004)

        2徐州醫(yī)科大學形態(tài)學研究中心(江蘇 221004)

        3江蘇省人工聽覺工程實驗室(江蘇221004)

        4徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院(江蘇221002)

        5湘南學院(湖南423000)

        耳鳴(Tinnitus)是在無任何聲源刺激情況下對聲音的感知。持續(xù)性或間歇性的耳鳴影響患者的心情,導致患者入睡困難、注意力無法集中、甚至影響工作和人際關(guān)系等問題[1]。目前耳鳴尚無有效的治療方法,相關(guān)的機制尚不清楚。水楊酸鹽是目前用來建立動物耳鳴模型的常見藥物之一[2]。水楊酸鹽誘發(fā)耳鳴常伴有不同程度的聽力下降,這種聽覺剝奪引起聽皮層的興奮活動增強和/或抑制活動減弱導致中樞增益增加,神經(jīng)元異?;罨痆3,4]。聽皮層過度興奮可能是耳鳴的主要原因[5-7],因此聽皮層在耳鳴中的研究就顯得尤為重要。

        研究發(fā)現(xiàn)焦慮、心理壓力與免疫系統(tǒng)的改變有關(guān)[8]??紤]到耳鳴與心理困擾之間的聯(lián)系,免疫因子在耳鳴中的研究受到關(guān)注。放松訓練減輕耳鳴患者的焦慮、壓力等癥狀,同時發(fā)現(xiàn)血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)降低[9]。水楊酸鹽誘導耳鳴動物模型中,聽覺中樞中包括TNF-α在內(nèi)的炎癥因子表達增加[10,11]。TNF阻滯劑依那西普顯著降低小鼠耳蝸水楊酸鹽誘導的耳鳴行為。這些結(jié)果提示,神經(jīng)炎癥可能是耳鳴的一種新機制,但其確切作用機理不明[12]。通過調(diào)節(jié)膜受體的插入和穩(wěn)態(tài)表達水平,TNF-α影響胞膜和胞內(nèi)的離子通道,從而調(diào)節(jié)突觸傳遞強度。在這些變化中最突出的改變是胞膜AMPA受體(AMPAR,α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體)的表達[12,13]。然而,TNF-α在耳鳴中的作用是否通過調(diào)節(jié)AMPAR表達來實現(xiàn)尚未見研究。因此,本研究采用長期腹腔注射水楊酸鹽建立大鼠耳鳴模型,觀察動物聽皮層中TNF-α和AMPAR的表達變化,初步探討TNF-α對耳鳴產(chǎn)生的可能機制,以期為耳鳴機制研究提供新思路。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1實驗動物

        使用健康成年雄性Sprague Dawley大鼠24只,清潔級,由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,體重240-260g,耳廓反射靈敏,均無噪聲接觸及耳毒性藥物應(yīng)用史。隨機分籠飼養(yǎng),將大鼠保持在12/12小時黑暗/光照循環(huán)中,不限制飲食和水。本實驗過程符合徐州醫(yī)科大學動物中心動物倫理管理條例規(guī)定。

        1.1.2實驗試劑

        水楊酸鹽(美國Sigma公司),細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),BCA測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),兔多克隆抗TNF-α抗體(美國Abcam公司),兔多克隆抗GluA1抗體(美國Millipore公司),鼠單克隆抗β-actin(美國Proteintech公司)

        1.2 方法

        1.2.1動物分組及模型制備

        所有組別的耳鳴模型基于先前的研究[10,14]。24只SD大鼠隨機分成4組,每組6只:Ⅰ、對照組(200 mg/kg生理鹽水腹腔注射,于上午8時和下午4時各注射一次,連續(xù)注射14天);Ⅱ、慢性注射7天組(200 mg/kg水楊酸鹽腹腔注射,于上午8時和下午4時各注射一次,連續(xù)注射7天);Ⅲ、慢性注射14天組(200 mg/kg水楊酸鹽腹腔注射,于上午8時和下午4時各注射一次,連續(xù)注射14天);Ⅳ、停藥后恢復14天組(慢性注射水楊酸鹽14天后再停止注射恢復14天)。所有組別的大鼠分別于造模成功后的第二天上午8時處死。

        1.2.2 驚跳反射抑制(PPI)

        耳鳴檢測參照以往研究[15]。耳鳴檢測在聲衰減室中進行。動物感知到耳鳴后,我們采用脈沖前抑制-驚跳反射的方法篩選耳鳴大鼠。測量不同時間注射水楊酸或生理鹽水的大鼠前脈沖驚跳刺激的PPI值,進行組間比較。

        每次實驗中,將大鼠固定在裝有壓力感受器的平臺上,實驗前先置于65dB SPL白色背景噪聲中適應(yīng)。測試期間,首先隨機給予大鼠10次115dB SPL的脈沖刺激,隨后,通過揚聲器隨機給予30次聲刺激(10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒有前聲的驚跳反射刺激、10次前脈沖驚跳反射刺激)。驚跳刺激的時間間隔為27-32秒。PPI值為驚跳反射最大幅值減少百分比[(1-PPI/ASR)×100%]。根據(jù)公式 PPI(%)=1-(ASR-PPI)/ASR*100%,計算前脈沖抑制率。

        1.2.3 Western Blot

        每組6只大鼠用4%戊巴比妥那(50mg/kg)麻醉后,斷頭取腦迅速分離出聽皮層。將20%的組織置于蛋白酶抑制劑和裂解液中勻漿,冰上裂解30 min,4℃ 12000g離心30 min,收集上清,即為總蛋白。將膜蛋白抽提試劑A加入剩余組織中勻漿,冰上裂解20min,4℃ 700g離心10 min,收集上清;上清繼續(xù)4℃14000g離心30 min,吸取上清,即為細胞漿蛋白;將沉淀下來的細胞膜碎片繼續(xù)4℃14000g離心5 min,吸盡上清。加入膜蛋白抽提試劑B,震蕩5s,冰浴10min,同樣操作重復3次。隨后,4℃14000g離心10 min,收集的上清即為細胞膜蛋白。使用BCA測定試劑盒測定每個樣品的蛋白濃度。將提取的總蛋白或膜蛋白樣品加入到預制的8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離GluA1蛋白質(zhì)(膜蛋白),12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離TNF-α蛋白質(zhì)(總蛋白)。電泳結(jié)束后,用硝化纖維素膜進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉印跡膜2小時,4℃孵育兔多克隆抗TNF-α(1:1000)、兔多克隆抗GluA1(1:800)和鼠單克隆抗β-actin(1:5000),搖床過夜。第二天,TBST洗滌3次后,加入一抗種屬特異性熒光標記二抗(1:150)室溫下孵育2小時。TBST洗滌3次后,通過Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國Li-COR公司)掃描蛋白條帶。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析,組間均數(shù)差異性比較使用單因素方差分析(Dunnett事后檢驗)。TNF-α與GluA1的蛋白表達采用Pearson相關(guān)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(xi s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 水楊酸鹽成功誘導了大鼠耳鳴樣行為

        本實驗采用了聽覺驚跳反射來檢測動物的耳鳴樣行為。驚跳反射是骨骼肌對意想不到的強烈聲刺激的反射性收縮。驚跳刺激之前給予弱的聲刺激或前脈沖刺激時,動物的驚跳反射幅度被減弱,這種現(xiàn)象為前脈沖抑制(PPI),通過分析驚跳反射的幅度抑制程度來對耳鳴發(fā)生進行評估。本實驗所用的PPI程序是:在給予驚跳反射刺激前,發(fā)放三種不同強度的前脈沖驚跳刺激75 dB SPL、80 dB SPL和 85dB SPL(分別為 PPI 2,PPI 4和 PPI 8),并測量每種強度的前脈沖驚跳刺激所對應(yīng)驚跳反射的抑制程度。根據(jù)公式,計算出前脈沖抑制率。不同組別水楊酸鹽注射大鼠的PPI值(xi s)(圖1、表1)。與對照組、停藥后恢復14天組相比,慢性注射7天組,PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高(F=14.278,P=0.002,P<0.01;F=12.343,P=0.002,P<0.01;F=5.962,P=0.014,P<0.05);慢性注射14天組較對照組、停藥后恢復14天組,PPI2、PPI4和PPI8均 顯 著 升 高(F=14.278,P=0.000,P<0.001;F=12.343,P=0.000,P<0.001;F=5.962,P=0.002,P<0.01;);在對照組、停藥恢復14天組中,PPI2、PPI4和PPI8無顯著差異(F=14.278,P=0.175,P>0.05;F=12.343,P=0.706,P>0.05;F=5.962,P=0.582,P>0.05)。前脈沖抑制率越大,驚跳反射被抑制的幅度越小。注射水楊酸鹽后動物已耳鳴,耳鳴填補了背景噪聲的間隔,從而減小了前抑制作用。

        圖1水楊酸鹽對前脈沖抑制率的影響。A慢性注射7天組大鼠的PPI反應(yīng)測定;B慢性注射14天組大鼠的PPI反應(yīng)測定;C停藥后恢復14天組大鼠的PPI反應(yīng)測定;數(shù)值用均數(shù)±標準差表示;前脈沖刺激:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)Fig.1 Effect of salicylate on pre-pulse inhibition.A The PPI value measured in rats in the chronic(S7)group.B The PPI value measured in rats in the chronic(S14)group.C The PPI value measured in rats in the recovery(S14+R14)group.Results are expressed as mean±SD.Prepulse stimuli:PPI2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

        2.2 TNF-α在聽皮層中的表達

        慢性注射7天組、慢性注射14天組與對照組、停藥后恢復14天組相比,TNF-α蛋白表達顯著上升(F=5.381,0.727±0.241,P=0.036,P<0.05;0.820±0.283,P=0.003,P<0.01);慢性注射7天組與慢性注射14天組、對照組與停藥后恢復14天組的差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.496,P=0.699,P>0.05)。(圖2)

        圖2各組大鼠聽皮層均有TNF-α蛋白的表達。慢性注射7天組、慢性注射14天組與對照組、停藥后恢復14天組相比,TNF-α蛋白表達上升(P=0.036,*P<0.05;P=0.003,**P<0.01)(n=6);對照組、停藥后恢復14天組,TNF-α蛋白表達無明顯變化(P=0.699,P>0.05)(n=6)。Fig.2 Expression of TNF-α was evaluated using western Blot in the auditory cortex.The expression of TNF-α were markedly increased in chronic treatment groups(S7,S14)compared with control group and recovery group(S14+R14)(P=0.036,*P<0.05;P=0.003,**P<0.01,respectively)(n=6).There was no significant difference in TNF-α protein expression between control group and recovery group(P=0.699,P>0.05)(n=6).

        2.3 GluA1膜蛋白在聽皮層中的表達

        使用亞單位特異性抗體,通過Western免疫印跡顯示GluA1蛋白的表達模式(圖3)。慢性注射7天組與對照組相比,GluA1膜蛋白表達顯著升高(F=7.602,0.529±0.139,P=0.019,P<0.05);與對照組、停藥后恢復14天組相比,慢性注射14天組GluA1膜蛋白表達顯著升高(F=7.602,0.730±0.222,P=0.002,P<0.01)。慢性注射7天組與慢性注射14天組、對照組與停藥后恢復14天組的差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.079,P=0.398,P>0.05)。

        圖3各組大鼠聽皮層均有GluA1蛋白的表達。慢性注射7天組與對照組相比,GluA1膜蛋白表達上升(P=0.019,*P<0.05)(n=6);慢性注射14天組與對照組、停藥后恢復14天組相比,GluA1膜蛋白表達上升(P=0.002,**P<0.01)(n=6);對照組、停藥后恢復14天組的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.398,P>0.05)(n=6)。Fig.3 Expression of GluA1 in the auditory cortex.Compared with control group,membrane expression of GluA1 in the chronic treatment(S7)group was significantly increased(P=0.019,*P<0.05)(n=6).Membrane expression of GluA1 was significantly upper in the chronic treatment(S14)group compared to the control and recovery group(S14+R14)(P=0.002,**P<0.01)(n=6).There was no significant difference in GluA1 membrane protein expression between control group and recovery group(P=0.398,P>0.05)(n=6).

        2.4 TNF-α與GluA1蛋白在聽皮層中的相關(guān)性分析

        散點圖顯示的是在每個樣本中的TNF-α蛋白與GluA1膜蛋白的水平(圖4)

        表1 行為測量:不同組別間PPI值比較Table 1 Behavioral testing:Comparisons of PPI values among four groups

        圖4大鼠聽皮層TNF-α與GluA1蛋白的相關(guān)性注:TNF-α蛋白的表達與GluA1膜蛋白的表達在聽皮層中成正相關(guān),且有顯著的統(tǒng)計學差異(r=0.710,P=0.000,***P<0.001)。Fig.4 Correlation between the protein expression of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex in rats Note:There was a significantly positive correlation between the protein expression levels of TNF-α and GluA1 in the auditory cortex(r=0.710,P=0.000,***P<0.001).

        3 討論

        大劑量水楊酸鹽會使人和動物產(chǎn)生強烈的耳鳴感。PPI抑制率增高是動物耳鳴的表現(xiàn)[15]。PPI檢測反映了聽覺信息的快速處理過程受到高級認知中樞的調(diào)節(jié)[16]。通過與對照組相比,水楊酸鹽連續(xù)注射7天、14天組大鼠的PPI抑制率顯著增高,說明大鼠感知到耳鳴。但在水楊酸鹽停止注射恢復14天后大鼠PPI抑制率無明顯變化,大鼠耳鳴消失。

        當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到內(nèi)源或外源性刺激時,星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中會產(chǎn)生TNF-α,TNF-α被視作是耳鳴及情緒狀態(tài)的分子標志[9,17]。在耳鳴大鼠的中樞聽覺神經(jīng)系統(tǒng)里發(fā)現(xiàn)TNF-α基因表達呈可逆性增加[10,11]。在本實驗中,與對照組相比,長期注射水楊酸鹽誘導耳鳴大鼠聽皮層中TNF-α表達顯著升高;對照組、停藥后恢復14天組,TNF-α的表達無顯著差異。此結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致。TNF-α作為一種有效的促炎癥分子,改變神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放,調(diào)節(jié)離子通道的表達,使神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮增加和抑制減少,進一步影響神經(jīng)可塑性[18]。聽皮層過度興奮是耳鳴的感知基礎(chǔ),因此TNF-α可能參與聽皮層的過度活躍導致耳鳴產(chǎn)生[10]。

        離子型谷氨酸受體AMPAR位于腦中絕大多數(shù)谷氨酸能突觸上,介導大部分興奮性信號傳遞。AMPAR是同型或異型四聚體復合物,包含四種相似的GluA1-4亞基組合[19]。在神經(jīng)元活動過程中,TNF-α通過調(diào)節(jié)表面AMPAR的表達來影響突觸傳遞強度,并可能導致興奮毒性[20]。海馬神經(jīng)元中,TNF-α應(yīng)用可使含GluA1亞基的AMPAR表面表達量增加60%,而這些表面表達的變化伴隨著AMPAR介導的興奮性突觸后電流的顯著增加[21]。在本次免疫印跡實驗中發(fā)現(xiàn),長期水楊酸鹽應(yīng)用的耳鳴大鼠聽皮層中GluA1膜蛋白的表達水平顯著增加。膜蛋白GluA1的增加提示GluA1的過表達使插入突觸的同源GluA1/1受體增多,更多的AMPAR向可通透Ca2+的受體轉(zhuǎn)變,Ca2+可滲透的AMPAR(CP-AMPAR)表現(xiàn)出明顯的快速動力學和顯著的多胺敏感性而呈現(xiàn)出內(nèi)向整流,AMPAR發(fā)生鈣內(nèi)流增強了興奮性信號的傳遞。

        先前的研究發(fā)現(xiàn),TNF-α作用于腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)后引起一系列的信號改變,從而影響AMPAR的表達導致突觸強度的變化[13]。TNF-α作用于神經(jīng)元TNFR1,通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴性過程促進AMPAR的胞吐作用,改變了突觸AMPAR的分子化學計量,使得微型興奮性突觸后電流(mEPSC)的幅度和平均頻率增加,興奮性突觸信號傳遞增加[22]。TNFR1的激活對于TNF-α誘導AMPAR表面表達的增加是充分且必要的。使用各種蛋白激酶抑制劑以及COX的實驗表明,在TNFR1受體的下游,AMPAR表面表達增加需要PI3K活性[21]。Hwang等人發(fā)現(xiàn),在小鼠耳蝸注射300mg/kg水楊酸鹽后,TNFR1的mRNA表達增加[12]。結(jié)合本實驗中,長期水楊酸鹽注射后聽皮層中TNF-α和AMPAR的表達均增加,而且在時相上兩者有很強的相關(guān)性,故我們推測TNF-α可能通過作用于TNFR1,激活下游PI3K途徑,導致胞膜AMPAR插入增多,最終使得表面AMPAR增加,興奮性信號增強,參與耳鳴大鼠聽皮層的過度活化。

        總之,長期水楊酸鹽應(yīng)用導致大鼠耳鳴,這與聽皮層中炎癥因子TNF-α和興奮性受體AMPAR表達增多有關(guān)。然而,在水楊酸鹽誘導的動物耳鳴中,TNF-α表達與AMPAR變化之間的確切信號通路過程還需要進一步的研究來證實。

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