楊江霞， 白建英, 李付平△， 張秀芬， 徐昭娟， 趙 冬

(河北中醫(yī)學(xué)院 1實(shí)驗(yàn)中心， 2護(hù)理學(xué)院， 3教務(wù)處， 河北 石家莊 050200)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)大部分由單純性非酒精性脂肪肝發(fā)展而來，主要病理表現(xiàn)為肝臟的脂肪沉積及肝臟纖維化，大部分在不攝取過量酒精的情況下發(fā)展[1]。NAFLD引起的肝臟脂肪變性和肝臟纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌[2]。高血壓、高血脂及肥胖是NAFLD的高危因素[3]。雙擊理論是目前公認(rèn)的NAFLD的病理進(jìn)展學(xué)說之一，第1個打擊是指肝細(xì)胞的脂肪酸沉積，從而導(dǎo)致了炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子升高及氧化應(yīng)激的第2次打擊，最終導(dǎo)致肝臟損傷、感染及纖維化，其中，炎癥細(xì)胞肝臟浸潤及炎癥因子包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6等的釋放對肝臟的損傷被認(rèn)為是NAFLD的重要病理生理過程[4]。目前臨床上無特異性針對治療NAFLD的藥物。

白刺屬(Nitraria)是蒺藜科一個古老的屬，為多分枝的耐鹽喜潛水旱生低矮灌木，主要分布在荒漠。有研究證明白刺果的有效成分花色苷(anthocyanins，Anth)可緩解脂肪肝癥狀[5]。有研究表明，提高胰島素敏感性，降低體重可緩解NAFLD，而花色苷也可以刺激胰島素分泌，降低體重。利用高脂飲食(high-fat diet，HFD)可構(gòu)建NAFLD小鼠模型，已知NAFLD會伴有炎癥因子上調(diào)[6]。本研究利用花色苷對NAFLD小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，研究其是否能緩解由NAFLD引起的肝功能異常及作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年C57BL/6小鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，許可證號為SCXK(冀)2014-1-009，相對濕度45%～55%，每天光照12 h，SPF動物房飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 油紅O染色試劑盒(上海魯汶生物科技有限公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine ami-notransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Masson’s trichrome染色試劑盒(Biosis)；抗TNF-α抗體(Santa Cruz)；抗IL-1β抗體(Abcam)；抗IL-6和IL-10抗體(Cell Signaling Technology)；抗CCL7和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)抗體(Bioworld)。

2 方法

2.1 小鼠HFD模型的構(gòu)建及分組 24只小鼠分為3組，每組8只，分別為：對照(control)組，正常飲食；HFD組，給予高脂飲食30周；HFD+Anth組，給予高脂飲食30周后，每天腹腔注射花色苷(2 mg/kg)，持續(xù)4周，對照組及HFD組則給予等量生理鹽水腹腔注射。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠稱重后，斷頭取血，分離血清，解剖小鼠肝臟并稱重。

2.2 血清ALT、AST、TC、TG和LDL-C的檢測 小鼠血清中ALT、AST、TC、TG和LDL-C的檢測按照相應(yīng)試劑盒說明書的方法，在96孔板上，制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在樣品孔加入樣品。待樣品與試劑共孵育2 h后，采用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處吸光度(A值)。各血清樣品中ALT、AST、TC、TG和LDL-C的含量采用對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

2.3 HE染色 小鼠肝臟組織經(jīng)4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固定、30%蔗糖脫水、石蠟包埋后5 μm切片，蘇木精染色洗滌后用伊紅染色后封片，顯微鏡觀察。

2.4 油紅染色 小鼠肝臟組織經(jīng)4% PFA固定后，釋放油紅儲存液，過濾后室溫放置10 min，染色10 min后脫色，蘇木素復(fù)染，PBS漂洗，甘油明膠封片顯微鏡觀察。

2.5 Masson染色 小鼠肝臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，Masson’s 試劑盒中試劑A染核15 min，充分水洗，顯藍(lán)后鏡檢，烘箱干燥，再使用試劑B染色10 min，再加入試劑C，清洗玻片，去除染液B，每次3 min，滴加試劑D處理3 min。95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明、中性樹膠封閉顯微鏡拍照。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測 小鼠肝臟組織經(jīng)4% PFA固定、30%蔗糖脫水、石蠟包埋后5 μm切片，先用枸椽酸鈉高溫修復(fù)后，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，之后以1200稀釋比例孵育Ⅰ抗體(F4/80、CD45、CD11b、CCL7及MCP-1)，4 ℃過夜。次日，PBS洗滌后用HRP標(biāo)記的 II 抗孵育1 h，之后用DAB顯色液顯影后顯微鏡拍照。

2.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平 取小鼠肝臟組織利用RIPA裂解液萃取細(xì)胞全蛋白。利用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V，2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以12 000的稀釋比例孵育Ⅰ抗體(TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10)， 4 ℃過夜;次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)的HRP(110 000)標(biāo)記的 II 抗1 h，以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，若數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布或方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)的兩兩比較用Bonferroni-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白刺果提取物花色苷降低高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝小鼠的肝重/體重比值，減輕肝臟功能異常

通過給予小鼠高脂飲食后，小鼠肝臟重量、ALT、AST、總膽固醇、甘油三酯及LDL-C均較對照組升高(P<0.01)；給予花色苷干預(yù)后，肝臟重量、ALT、AST、總膽固醇、甘油三酯及LDL-C均較HFD組降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Anthocyains attenuated liver weight, serum ALT level, serum AST level, serum TC level, serum TG level and serum LDL-C level in the NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD). Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHFD group.

圖1 花色苷能降低非酒精性脂肪肝的肝重，減輕肝臟功能異常

2 白刺果提取物花色苷減輕由高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝的纖維化

HE染色、油紅染色及Masson染色結(jié)果顯示，HFD組有明顯的肝臟纖維化、脂滴沉積及膠原纖維增生，而花色苷干預(yù)能明顯減輕這些由高脂飲食引起的纖維化表現(xiàn)，見圖2。

3 白刺果提取物花色苷降低由高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝組織的炎癥因子水平

Wester blot檢測結(jié)果顯示，HFD組小鼠肝臟的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10均較control組升高(P<0.01);HFD+Anth組小鼠肝臟的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10均較HFD組降低(P<0.01)，見圖3。

4 白刺果提取物花色苷能減輕非酒精性脂肪肝組織的巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤

通過免疫組織化學(xué)染色檢測巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志F4/80、CD45及CD11b，顯示高脂飲食能明顯導(dǎo)致肝臟巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞在肝臟中央靜脈周圍的浸潤，且與control組相比顯著增多(P<0.01)；而花色苷干預(yù)能降低巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞在肝臟浸潤的數(shù)目，且較HFD組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 2. Anthocyains attenuated hepatic fibrosis in NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD).

圖2 花色苷緩解非酒精性脂肪肝的纖維化

Figure 3. Anthocyains attenuated hepatic inflammatory factor levels in the liver tissues of NAFLD mice induced by high-fat diet (HFD). Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

圖3 花色苷能降低非酒精性脂肪肝的炎性因子水平

Figure 4. Anthocyains reduced infiltration of macrophages, leukocytes and monocytes in the liver tissues. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD group.

圖4 花色苷能緩解非酒精性脂肪肝組織巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞的浸潤

5 白刺果提取物花色苷可緩解由高脂飲食導(dǎo)致的小鼠肝臟CCL7與MCP-1的升高

免疫組化結(jié)果顯示,HFD組小鼠CCL7與MCP-1的表達(dá)水平較control組升高(P<0.01)；HFD+Anth組CCL7與MCP-1的表達(dá)水平較HFD組降低(P<0.01)，見圖5B。

Figure 5. Anthocyains inhibited the expression of chemokines CCL7 and MCP-1. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHFD group.

圖5 花色苷能降低非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織趨化因子CCL7及MCP-1的表達(dá)

討 論

因NAFLD后期進(jìn)展可致肝硬化及肝癌[7-8]，所以在前期有效的預(yù)防肝硬化具有十分重要的意義。有研究表明脂質(zhì)沉積[9]、氧化應(yīng)激[10]、炎癥因子釋放[11]和炎癥細(xì)胞浸潤[12]均可導(dǎo)致肝硬化和肝損傷，也是NAFLD的重要病理發(fā)展過程。本研究利用高脂飲食建立小鼠NAFLD模型，結(jié)果顯示高脂飲食可降低肝功能、增加體重及促進(jìn)肝臟纖維化，而白刺果提取藥花色苷則緩解了這一癥狀。

炎癥細(xì)胞肝臟浸潤及炎癥因子釋放對肝臟的損傷被認(rèn)為是NAFLD的重要病理生理過程。而炎癥細(xì)胞可釋放多種炎癥因子及細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。TNF-α和IL-1β主要來源于急性或慢性肝損傷時的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞[13]。研究表明，通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤及其釋放炎癥因子可緩解NAFLD的病理進(jìn)程[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可導(dǎo)致炎細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞及單核細(xì)胞在肝臟的廣泛浸潤，從而釋放多種炎癥因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10，從而導(dǎo)致肝損傷，而花色苷可明顯緩解炎細(xì)胞浸潤，減少炎癥因子在肝內(nèi)的聚集，從而改善NAFLD的病理改變，與以往研究一致。

CCL7及MCP-1是肝臟中單核細(xì)胞重要的趨化因子[16]。在急性或慢性肝損傷中，MCP-1可趨化單核細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝纖維化。CCL7，也被稱為單核細(xì)胞趨化蛋白3，屬于MCP家庭成員。單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可釋放CCL7，從而導(dǎo)致炎癥[17]。CCL7與MCP-1的釋放增多可趨化各種炎細(xì)胞增殖并釋放炎癥因子[18-19]。而本研究也發(fā)現(xiàn)在高脂飲食中，CCL7及MCP-1在肝內(nèi)的表達(dá)明顯增高，而花色苷可明顯減少CCL7及MCP-1的表達(dá)，從而使炎細(xì)胞趨化作用減弱，炎性因子釋放減少，從根本上改善NAFLD。

綜上所述，我們證實(shí)了花色苷能緩解由高脂飲食引起的肝功能損傷和肝纖維化，其機(jī)制主要是由于花色苷能降低炎癥趨化因子CCL7及MCP-1，從而減少炎癥細(xì)胞在肝臟內(nèi)的浸潤，進(jìn)而減少炎癥因子的釋放，從而減慢了肝臟纖維化的進(jìn)程。因此，花色苷可作為NAFLD潛在的預(yù)防及治療藥物，但是，臨床上的效果尚待進(jìn)一步的驗(yàn)證。