朱含章， 葛 珂， 劉 凌， 沈偉敏， 賈長庫

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科， 浙江 杭州 310006)

肝纖維化是一種嚴重影響人類健康的疾病，可以發(fā)展成肝硬化和肝細胞癌等嚴重疾病[1-2]，目前尚無顯著有效的臨床治療方法。因此，開發(fā)對該疾病合適的治療途徑是至關(guān)重要的。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纖維化的原發(fā)效應(yīng)細胞，活化的肝星狀細胞分化為成纖維細胞，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)[3-5]。因此，抑制HSC活化可能是有前景的治療肝纖維化的措施[6]。線粒體是一種與細胞功能狀態(tài)高度相關(guān)的細胞器，在細胞增殖與凋亡過程中起著重要作用[7]。線粒體融合蛋白(mitofusin，Mfn)基因已在近年來克隆成功，Mfn基因在哺乳動物中有2種分子，即Mfn1和Mfn2，其中Mfn2是一種細胞增殖抑制基因，是促進線粒體融合所必須的成分，在促進細胞凋亡方面發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[8]。Mfn2對HSC的活化作用以及在肝纖維化的患者或者動物實驗中Mfn2是否發(fā)生了變化，目前尚未有研究證實。

在以往的研究中，我們成功構(gòu)建并鑒定了載有大鼠線粒體融合蛋白2(rMfn2)基因的重組腺病毒Ad5-mCMV-rMfn2-EGFP過表達載體，但該表達為瞬時性，且當(dāng)時未驗證Mfn2基因的功能及其作用機制[9]。由于慢病毒相較于腺病毒具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達的優(yōu)勢，因此，慢病毒介導(dǎo)Mfn2在HSC過表達是一種有效的方法。本研究旨在探討轉(zhuǎn)染慢病毒過表達載體CV072-pCMV- Mfn2-EGFP在細胞實驗水平對HSC凋亡和纖維化相關(guān)蛋白的表達的影響，并進一步通過TGF-β1通路蛋白的變化評估慢病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的Mfn2穩(wěn)定過表達在細胞實驗水平影響肝纖維化相關(guān)因子生成的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠肝星狀細胞株HSC-T6 購自中國科學(xué)研究院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco；Polybrene購自Sigma；TRIzol試劑和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)購自Thermo Fisher；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶和SYBR? Premix Ex TaqTMII系統(tǒng)購自TaKaRa；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自BD；PVDF膜(Merck Millipore，0.2 μm)；單克隆兔抗大鼠Mfn2、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、Smad2和Smad3抗體購自Abcam；單克隆兔抗大鼠GAPDH抗體和羊抗兔的辣根過氧化物酶標記的IgG購自Cell Signalling Technology；Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；慢病毒過表達載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；其余試劑為國產(chǎn)市售試劑。超濾管為Vivaspin? 20 Centrifugal Concentrator (Sartorius)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇HSC-T6細胞，加入含10%胎牛血清、1%卡那霉素和新霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，并加入PDGF(終濃度為5 μg/L)，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液，細胞長至80%左右，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，選對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，均勻接種于6 孔板中，接種密度為每孔5×104。

2.2 含Mfn2的慢病毒載體的構(gòu)建 由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，根據(jù)GenBank的大鼠Mfn2基因序列(NM_130894)將其作為目的基因，篩選和構(gòu)建慢病毒Mfn2過表達載體，通過測序驗證，證實構(gòu)建成功。經(jīng)酶切、電泳及Western blot 檢測驗證，證實Mfn2慢病毒過表達載體CV072-PCMV- Mfn2-EGFP(以下簡稱Lv-Mfn2)過表達成功后，進行慢病毒大規(guī)模包裝并測定滴度。

2.3 慢病毒過表達載體Lv-Mfn2轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞 HSC-T6細胞接種于6孔板中，至70%～90%匯合度時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換無血清無卡那霉素和新霉素的新鮮培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換液，更換為含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每孔添加重組慢病毒和空載病毒(Vec)5×107TU，以未添加病毒的空白細胞作為對照(MOCK)。每孔中添加Polybrene濃度為8 mg/L，在37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染12 h，PBS沖洗換液。進一步培養(yǎng)24～48 h，熒光顯微鏡下觀察Mfn2過表達(Lv-Mfn2)、Vec組和MOCK組細胞中綠色熒光蛋白的表達情況及轉(zhuǎn)染效率。

2.4 RT-qPCR檢測Mfn2的mRNA表達 采用實時熒光定量PCR 法，按照TRIzol試劑說明提取細胞總RNA，用TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Mfn2的上、下游引物序列分別為5’-GATGACAGAGGAAGTGGAAAGGC-3’和5’-ACAGACACAGGAAGA-AGGGGCT-3’；GAPDH的上、下游引物序列分別為5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’和5’-TTTGAG-GGTGCAGCGAACTT-3’。反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)立2 個復(fù)孔，熱循環(huán)程序為：95 ℃ 3 min；然后95 ℃變性20 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和溶解曲線，以GAPDH 為內(nèi)參照，計算目的基因Mfn2的mRNA相對水平，用2-ΔΔct表示。

2.5 Western blot檢測Mfn2、α-SMA、 Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白水平 將3組細胞分別加入適量細胞裂解液，使用細胞刮將細胞分別收集至1.5 mL離心管中，用RIPA 蛋白裂解液裂解，置于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取蛋白上清分裝于1.5 mL離心管中，采用BCA 法測定蛋白濃度。取總蛋白150 μg，行10% SDS-PAGE ，經(jīng)PVDF 膜轉(zhuǎn)移，加 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，孵育II抗(1 5 000)，室溫振搖1 h；TBST漂洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法曝光。采用Image Lab 軟件對Wes-term blot 檢測結(jié)果進行灰度分析，灰度值代表蛋白相對表達量。

2.6 ELISA檢測I型、Ⅲ型和IV型膠原蛋白在HSC-T6細胞培養(yǎng)上清中的含量 HSC-T6細胞分組培養(yǎng)48 h后，收集上清液，用ELISA試劑盒測定上清液中Ⅰ型、Ⅲ型和IV型膠原的含量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。每組實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)行多組間比較，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢病毒轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞后綠色熒光蛋白的表達情況及轉(zhuǎn)染效率評估

倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后Mfn2過表達組、空載病毒組和空白組細胞中綠色熒光蛋白表達情況及轉(zhuǎn)染效率。使用細胞計數(shù)法評估，Mfn2過表達組和空載病毒組的細胞轉(zhuǎn)染效率均大于90%，見圖1。

Figure 1. The expression of green fluorescent protein and transfection efficiency in Mfn2 lentivirus over-expression (Lv-Mfn2)group, empty virus (Vec) group and blank (MOCK) group after lentivirus transfection were observed under inverted fluorescence microscope.

圖1 Lv-Mfn2組、Vec組和MOCK組中HSC-T6細胞的形態(tài)和綠色熒光蛋白的表達情況

2 RT-qPCR和Western blot法檢測慢病毒轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞后Mfn2的mRNA和蛋白表達

慢病毒轉(zhuǎn)染后，Mfn2過表達組、空載病毒組和空白組培養(yǎng)48 h。使用RT-qPCR和Western blot法檢測Mfn2的mRNA和蛋白表達，結(jié)果表明，Mfn2過表達組Mfn2的mRNA表達相對于空載病毒組和空白組均明顯上升(P<0.01)，見圖2A；同時，Mfn2過表達組Mfn2蛋白的表達水平與空白組和空載病毒組比較均明顯上升(P<0.01)，見圖2B。

Figure 2. The mRNA (A) and protein (B) expression of Mfn2 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

圖2 各組HSC-T6細胞轉(zhuǎn)染后Mfn2的mRNA和蛋白表達情況

3 Western blot法檢測α-SMA的表達

Mfn2過表達組α-SMA的表達水平與空白組和空載病毒組比較均明顯降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The protein expression of α-SMA in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

圖3 各組細胞平滑肌肌動蛋白α-SMA的表達情況

4 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的水平

與空載病毒組和空白組比較，Mfn2過表達組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The protein levels of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group;##P<0.01vsVec group.

圖4 各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3水平的變化

5 Western blot檢測TGF-β1/Smad通路TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白水平

與空載病毒組和空白組比較，Mfn2過表達組中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平均降低(P<0.05)。而3組間Smad2和Smad3總蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

6 ELISA法檢測I型、Ⅲ型和IV型膠原蛋白在HSC-T6細胞培養(yǎng)上清中的含量

與空載病毒組和空白組比較，Mfn2過表達組I型、Ⅲ型和IV型膠原蛋白的水平均降低(P<0.05)，見圖6。

討 論

近年來的研究表明，肝纖維化的消減與活化狀態(tài)的HSC減少有關(guān)，凋亡是導(dǎo)致活化HSC 減少的中心環(huán)節(jié)，而不是HSC表型的轉(zhuǎn)化。HSC凋亡減少增加活化HSC的數(shù)量，不引起細胞器的破壞和微環(huán)境的炎癥損傷[10-11]。因此，促進活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的重要手段。Mfn2已被研究證明可促細胞凋亡，但在肝纖維化方面未有研究報道[12]，為了觀察Mfn2是否和肝纖維化有關(guān)聯(lián)，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染HSC的方式使Mfn2過表達，觀察其對HSC活化的作用，并測定平滑肌肌動蛋白α-SMA和各型膠原蛋白等肝纖維化相關(guān)因子，從而間接預(yù)測其對肝纖維化的影響。

Figure 5. The protein levels of TGF-β1, p-Smad2, p-Smad3, Smad2 and Smad3 in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMOCK group；##P<0.01vsVec group.

圖5 各組細胞TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2和Smad3水平的變化

Figure 6. The levels of type I, type III and type IV collagen (COL I, COL III and COL IV) in the cell culture supernatants in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMOCK group；#P<0.05vsVec group.

圖6 各組細胞培養(yǎng)液上清中I型、Ⅲ型和IV型膠原蛋白水平的變化

以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)具有可感染分裂細胞和非分裂細胞，及免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，還可以通過將其攜帶的基因片段整合到宿主細胞基因組，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達，而且感染效率高，免疫原性低[13-14]，因此我們選擇CV072-pCMV-EGFP慢病毒載體攜帶Mfn2基因以達到高效轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞的目的，同時也可減少對周圍組織的毒副作用。結(jié)果證實CV072-pCMV-Mfn2-EGFP轉(zhuǎn)染HSC后高效表達Mfn2，同時纖維化的標志性蛋白α-SMA表達降低。進一步的，我們檢查了Mfn2和HSC-T6細胞凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系，結(jié)果證實Mfn2增加HSC-T6凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少。為了深入探討Mfn2和HSC-T6細胞的肝纖維化相關(guān)蛋白表達的關(guān)系及機制，我們選取了肝纖維化的重要通路TGF-β1/Smad通路進行研究。TGF-β可調(diào)節(jié)細胞生長和分化的多肽，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有活化HSC，促進膠原蛋白表達，促進基質(zhì)合成與沉積等作用，是最重要的促肝纖維化細胞因子之一[15]。Smads蛋白是TGF-β受體復(fù)合物下游起重要作用的信號分子，TGF-β通過與Smad2和Smad3等結(jié)合，使其發(fā)生磷酸化，隨后引起靶基因的轉(zhuǎn)錄，膠原等細胞外基質(zhì)大量合成，進而促進肝纖維化[16]。我們的研究表明，Mfn2過表達可下調(diào)HSC-T6細胞的TGF-β1 及p-Smad2和p-Smad3的蛋白水平，而對Smad2 和Smad3非磷酸化蛋白無影響，導(dǎo)致TGF-β1/Smad通路的抑制，并引發(fā)α-SMA及I型、Ⅲ型和IV型膠原蛋白的表達下調(diào)，發(fā)揮拮抗肝纖維化相關(guān)因子生成的作用。

目前肝纖維化機制的研究表明，多種信號通路調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，如NF-кB/IкBα、 p38 MAPK，抑制Ras、ERK1/2及JNK1/2介導(dǎo)的MAPK 信號通路傳導(dǎo)則可以抑制HSC的過度增殖，促進其凋亡，而Mfn2 蛋白已被證實是Ras、ERK、JNK等MAPK 信號傳導(dǎo)的負性調(diào)節(jié)因子，因此在HSC中，Mfn2基因抑制肝纖維化相關(guān)因子生成的機制亦可能與MAPK 信號通路的傳導(dǎo)有關(guān)[17-18]。此外抑制PI3K/Akt和mTOR通路亦可促進HSC凋亡， 導(dǎo)致肝纖維化[18-19]，因此，我們推測Mfn2還可能通過多種其它信號通路抑制肝纖維化相關(guān)因子生成，從而調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Mfn2促進HSC凋亡和抑制肝纖維化相關(guān)因子生成的具體機制還值得進一步探索。在今后的實驗中，我們還將在動物實驗中進一步觀察Mfn2引發(fā)的肝纖維化相關(guān)因子的變化及對肝纖維化進展的影響，從而為Mfn2是否參與肝星狀細胞的凋亡調(diào)控及肝纖維化的調(diào)節(jié)提供更為充分的證據(jù)。