黃伯萬， 黃 強(qiáng)， 姜遠(yuǎn)旭△

(1 湛江中心人民醫(yī)院麻醉科， 廣東 湛江 524037； 2暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院麻醉科， 深圳市麻醉醫(yī)學(xué)工程研究中心， 廣東 深圳 518020)

在外科手術(shù)過程中，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，以及患者血壓下降導(dǎo)致的急性腦缺血/缺氧，均可誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)細(xì)胞受損[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞，在宿主防御和組織修復(fù)方面起重要作用[3]。生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞常處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)腦部缺血/缺氧、炎癥和感染時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，產(chǎn)生釋放大量的促炎細(xì)胞因子，破壞神經(jīng)細(xì)胞和血腦屏障[4-5]。

異丙酚(propofol,P)是一種短效靜脈麻醉藥，具有作用迅速和維持時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，臨床上廣泛用于全身麻醉和ICU鎮(zhèn)靜[6]。Propofol對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的抗炎作用[7]，但具體機(jī)制仍不清楚。瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道V亞族成員1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1, TRPV1)是一種非選擇性陽(yáng)離子通道[8]。研究表明，TRPV1是小膠質(zhì)細(xì)胞多種激活途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥有重要的作用[9-11]。本項(xiàng)工作參照以往研究[12-13]，擬建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞模擬外科手術(shù)過程中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，探討propofol抗神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制，為propofol在手術(shù)中用于預(yù)防神經(jīng)炎癥提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 藥物和試劑 Propofol購(gòu)自Fresenius Kabi AB；lipopolysaccharide購(gòu)自Sigma；TRPV1抑制劑AMG517購(gòu)自Selleck；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA試劑盒購(gòu)自RayBiotech；抗白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、TNF-α、TRPV1、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)、p-CaMKII和β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；Fluo-3 AM購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；TRPV1和β-actin引物由中國(guó)上海英濰捷基合成提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞在溫度為37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10% 胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞隔天換液 1 次， 細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%～90% 左右時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 細(xì)胞干預(yù) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)加入0.25%含EDTA的胰酶消化，重懸細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照(control, C)組、單獨(dú)LPS處理(L)組、L+P組和LPS+AMG517(L+A)組。L組在不含血清的培養(yǎng)液中加入LPS(100 μg/L)處理4 h；L+P組和L+A組分別用propofol(100 μmol/L)和AMG517(0.6 μmol/L)預(yù)處理1 h，隨后加入LPS(100 μg/L)處理4 h。另設(shè)單獨(dú)propofol處理組：在不含血清的培養(yǎng)液中加入propofol(100 μmol/L)處理4 h。按實(shí)驗(yàn)需求收集細(xì)胞。上述藥物劑量嚴(yán)格參照以往的研究[14-16]。

2.3 ELISA檢測(cè) 在相應(yīng)的時(shí)點(diǎn)收集處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，檢測(cè)TNF-α含量的變化。

2.4 Real-time PCR TRIzol收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，冰上裂解 5 min，加0.2 mL氯仿，渦旋振蕩混勻；4 ℃、12 000×g離心 5 min; 轉(zhuǎn)上層水相(約400 μL) 于另一1.5 mL EP 管中；加入等體積異丙醇，振蕩混勻；4 ℃、12 000×g離心 10 min；棄上清，加入預(yù)冷的 75% 乙醇 1 mL；4 ℃、12 000×g離心 5 min; 棄上清， 加無水乙醇 1 mL；4 ℃、 12 000×g離心 5 min; 棄上清， 空氣干燥5～10 min; 溶于 40 μL DEPC水中，使用 NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè) RNA 濃度并校準(zhǔn)， 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR步驟嚴(yán)格按照TaKaRa說明書操作，應(yīng)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算。β-actin的正向引物序列為5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’,反向引物序列為5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3’; TRPV1的正向引物序列為5’-CCGGCTTTTTGGGAAGGGT-3’，反向引物序列為5’-GAGACAGGTAGGTCCATCCAC-3’。

2.5 Western blot 在相應(yīng)的時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰上裂解 5 min，4 ℃、12 000×g離心 10 min；提取的細(xì)胞蛋白用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配制凝膠，12%分離膠，5% 濃縮膠; 上樣量 50 μg，120 V恒壓電泳，結(jié)束后取出凝膠，和相同大小的PVDF置于3層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)膜液，恒壓100 V電轉(zhuǎn)約90 min。取出PVDF膜，浸泡于TBST中5 min；放入 5% 脫脂奶粉中封閉，室溫下1 h；TBST 洗3次，每次 10 min， 加 I 抗， 4 ℃過夜； TBST 洗 3 次，每次 10 min; 加 II 抗，室溫下1 h; TBST 洗 3 次， 每次 10 min，暗房曝光，并使用 ImageJ 統(tǒng)計(jì)條帶強(qiáng)度。

2.6 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè) 用0.25%含EDTA的胰酶消化處理后的細(xì)胞于流式管中，500×g離心 5 min，棄上清，用PBS洗滌2次，加入100 μL Fluo-3 AM(5 μmol/L)室溫避光重懸浮30 min，然后加入PBS終止染色，500×g離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS重懸。應(yīng)用流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Propofol對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α的影響

與C組相比，L組TNF-α水平顯著升高(P<0.01)，表明造模成功；與C組相比，單獨(dú)propofol處理TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與L組相比，propofol預(yù)處理1 h和與LPS共同處理在4 h內(nèi)TNF-α的水平均能顯著降低(P<0.01)；與L組相比，propofol與LPS共同處理6 h，TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1. Effect of propofol on LPS-stimulated TNF-α production. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

圖1 Propofol對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α的影響

2 Propofol對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TRPV1 mRNA表達(dá)的影響

與C組相比，L組TRPV1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與L組相比，L+P組TRPV1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),見圖2。

Figure 2. Expression of LPS-stimulated TRPV1 mRNA. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

圖2 Propofol對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞TRPV1 mRNA表達(dá)的影響

3 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子和TRPV1蛋白表達(dá)的影響

與C組相比，L組TNF-α、IL-6和IL-1β和TRPV1的蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)；與L組相比，L+P組和L+A組TNF-α、IL-6、IL-1β和TRPV1的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Effects of propofol or AMG517 (0.6 μmol/L) on LPS-stimulated TRPV1, TNF-α, IL-1β and IL-6 protein expression. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

圖3 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子和TRPV1蛋白表達(dá)的影響

4 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

與C組相比，L組Ca2+濃度顯著升高(P<0.05)；與L組相比，L+P組和L+A組Ca2+濃度顯著降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. Effects of propofol or AMG517 (0.6 μmol/L) on LPS-stimulated intracellular Ca2+concentration. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsC group;**P<0.01vsL group.

圖4 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

5 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞p-CaMKII的影響

與C組相比，L組p-CaMKII的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與L組相比，L+P組和L+A組p-CaMKII的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖5。

討 論

在外科手術(shù)圍術(shù)期，神經(jīng)炎癥反應(yīng)較為常見，如不能有效干預(yù)，術(shù)后可導(dǎo)致腦損傷[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一類巨噬細(xì)胞，可分為M1和M2 2種類型。M1型主要發(fā)揮促炎功能，可分泌炎性因子如TNF-α和IL-6等，引發(fā)炎癥反應(yīng)，具有顯著的神經(jīng)毒性作用，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用于體外神經(jīng)炎癥研究已被廣泛使用[3,17]。神經(jīng)炎癥的特征之一是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，它的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放(如TNF-α、IL-1β和IL-6)，可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥、帕金森癥等疾病[18]。LPS是經(jīng)典的炎癥模型誘導(dǎo)藥物[19]，當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激后，NF-κB從NF-κB-IκB 復(fù)合物中解離并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而啟動(dòng)炎癥介質(zhì)的表達(dá)如TNF-α、IL-1β和IL-6[20]。因此，在本研究，我們通過使用LPS處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體外神經(jīng)炎癥模型，評(píng)估propofol在小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用。

Figure 5. Effects of propofol on LPS-induced phosphorylation of CaMKII. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsC group;**P<0.01vsL group.

圖5 Propofol和AMG517對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞p-CaMKII的影響

既往研究顯示，propofol通過抑制炎性因子的表達(dá)，減少炎性因子、粒細(xì)胞在腦組織的浸潤(rùn)和活化，來減輕腦組織的損害[7]。本研究中，證實(shí)在LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥體外模型，propofol能夠抑制TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。然而，propofol抗炎作用的具體機(jī)制尚不明確。

已有研究表明，TRPV1抑制劑能夠減弱LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，其機(jī)制與炎癥小體的抑制和IL-1β的釋放減少有關(guān)[9-11]，這提示我們TRPV1在神經(jīng)炎癥中扮演重要的角色。在本研究中，我們觀察到，LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞能夠上調(diào)TRPV1表達(dá)，propofol干預(yù)處理能夠下調(diào)TRPV1表達(dá)，提示TRPV1參與LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步確定TRPV1是否參與到這個(gè)過程，我們使用AMG517(TRPV1通道小分子抑制劑)作干預(yù)，顯示干預(yù)后細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)受到抑制。既往研究證實(shí)，激活的TRPV1促進(jìn)p-CaMKII的表達(dá)，增加Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣超載，從而興奮感覺神經(jīng)元，釋放興奮性氨基酸和多種神經(jīng)肽，進(jìn)而激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，介導(dǎo)炎癥因子的釋放[21-23]。而我們也證實(shí)，propofol治療能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞p-CaMKII的表達(dá)及降低胞內(nèi)Ca2+濃度，提示propofol通過TRPV1抗小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制與p-CaMKII表達(dá)及胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。