趙蓉蓉， 付兆媛

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2腫瘤科， 甘肅 蘭州 730000)

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在過去的幾十年里其發(fā)病率迅速上升[1]。在歐美、日本等發(fā)達(dá)國家由于醫(yī)療條件先進(jìn)，胃癌患者5年生存率普遍高于我國[2]。我國大部分胃癌患者確診時已是晚期，且該病易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以根除，只能采用傳統(tǒng)保守化療方式。而現(xiàn)有化療藥物絕大多數(shù)易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致臨床上治療效果不佳以及預(yù)后不良[3]。胃癌仍然是導(dǎo)致我國居民死亡原因的重大疾病之一[4]。探索新型胃癌生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)是我國科技工作者的迫切任務(wù)。

最近研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在胃癌的發(fā)病和進(jìn)展中扮演著重要角色[5-7]，這為我們研究這種重大疾病的治療靶點(diǎn)提供了潛在的方向。研究表明miRNAs的異常表達(dá)在胃癌的發(fā)病與惡性生物學(xué)表型，比如胃癌細(xì)胞的增殖[8]、侵襲[9]和遷移[10]等行為中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miR-330廣泛表達(dá)于各類型腫瘤中，且已有研究表明其表達(dá)水平與腫瘤的臨床特征和預(yù)后相關(guān)[11-13]。但miR-330在不同腫瘤中作用并不一致，如miR-330在結(jié)直腸癌[11]、肺癌[12]和乳腺癌[13]組織中表達(dá)下調(diào)，并且可以抑制腫瘤進(jìn)展；而另有研究發(fā)現(xiàn)miR-330在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤惡性生物學(xué)行為[14]。盡管miR-330研究較多，且在不同腫瘤組織表達(dá)和作用不一致，但miR-330在胃癌研究中較少，因此，在本研究中我們探索miR-330在胃癌疾病發(fā)展中的生物學(xué)效應(yīng)和意義，期待為理解胃癌的發(fā)病機(jī)理與治療學(xué)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人胃癌細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901和AGS及人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1均購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco； Lipofectamine 3000購自Invitrogen； 8 μm孔徑Transwell 24孔板購自Corning； CCK-8細(xì)胞試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；抗GAPDH抗體和抗早期生長反應(yīng)蛋白2(early growth response protein 2,EGR-2)抗體購自Santa Cruz；miR-330抑制劑(miR-330 inhibitor,miR-330-i)、miRNA抑制劑陰性對照(negative control miRNA inhibitor，NC-i)、miR-330模擬物(miR-330 mimic，miR-330-m)和miRNA模擬物陰性對照(negative control miRNA mimic,NC-m)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

2 樣本收集

收集2015年6月～2017年6月甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科48例行胃鏡檢查攝取的胃癌組織及配對癌旁組織(距腫瘤邊緣2.5 cm處胃黏膜組織)。所有患者均首次檢驗(yàn)確定為胃癌，且患者確診之前未進(jìn)行過放化療，并收集患者病理資料。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞BGC-823、SGC-7901和AGS及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1接種于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d 換1次液，每周按照1 ∶3傳代。

3.2 miR-330 inhibitor/mimic的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期BGC-823和SGC-7901細(xì)胞消化后，按照5×108/L的密度分別接種于6孔板中，待細(xì)胞70%融合，按照說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取miR-330-i、NC-i、miR-330-m和NC-m分別在無血清培養(yǎng)基中結(jié)合Lipofectamine3000，然后分別轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基的BGC-823、SGC-7901細(xì)胞中并孵育6 h，更換10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3.3 EGR-2-siRNA的轉(zhuǎn)染 取已轉(zhuǎn)染miR-330-m的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞，按照說明書操作步驟，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染NC-siRNA和EGR-2-siRNA，構(gòu)建miR-330-m+NC-siRNA和miR-330-m+EGR-2-siRNA的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞。

3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取已/未轉(zhuǎn)染的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化12 h后，按照每孔5×103細(xì)胞的密度接種于96孔板，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，按照CCK-8試劑盒說明書操作步驟，棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 °C反應(yīng)1 h，酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的吸光度(A)值。

3.5 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取已/未轉(zhuǎn)染的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞無血清培養(yǎng)基同步化12 h后，按照每孔100細(xì)胞的密度接種于24孔板中，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，去除舊培養(yǎng)基，PBS輕柔洗2遍，甲醇固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞集落數(shù)并拍照。

3.6 Transwell 細(xì)胞遷移分析 已/未轉(zhuǎn)染的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞無血清培養(yǎng)基同步化12 h后，按照每孔5×103細(xì)胞的密度接種于Transwell小室上槽腔中(24孔板，Transwell 的孔徑為8 μm)，密度為每孔5×104細(xì)胞(100 μL)，并在下槽腔內(nèi)加入600 μL含20% FBS培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取小室，小心擦除小室上槽腔上表面未遷移的細(xì)胞后，PBS漂洗2遍，置于90%乙醇中固定10 min，加0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS漂洗3遍，Olympus IX73倒置顯微鏡下觀察并拍照，并隨機(jī)選5個視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3.7 RT-qPCR檢測 按照TRIzol說明書操作進(jìn)行提取組織和細(xì)胞中總RNA。提取的總RNA以適宜體積DEPC水溶解，RNA 濃度用Qubit 2.0螢光計(jì)進(jìn)行定量。以1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(總體系為10 μL)，逆轉(zhuǎn)錄完成后按照SuperReal PreMix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時定量PCR(反應(yīng)體系為20 μL)，并用RT-qPCR的方法檢測基因的表達(dá)。 miR-330的正向引物序列為5’-GTGGAGGCAACATCATTGCTG-3’，反向引物序列為5’-GCCACTGGTACATTGGTCACA-3’； U6的正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；EGR-2的正向引物序列為5’-CGGTGACCATCTTCCCCAAT-3’， 反向引物序列為5’-GAGCGAAGCTACTCGGATACG-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，反向引物序列為 5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。qPCR循環(huán)反應(yīng)條件為94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、74 ℃ 10 s，共35個循環(huán)。miR-330以U6為內(nèi)參照，EGR-2以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析相對表達(dá)量。

3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 已/未轉(zhuǎn)染的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后，加入蛋白裂解液萃取細(xì)胞總蛋白。蛋白經(jīng)常規(guī)SDS-PAGE、濕法電轉(zhuǎn)、封閉后，室溫孵育抗EGR-2抗體(1 2 000稀釋)和抗GAPDH抗體(1 8 000稀釋)1.5 h，洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶偶聯(lián)的 II 抗(1 5 000稀釋)1 h，洗膜后，化學(xué)發(fā)光法暗室顯影，ImageJ 1.48u軟件掃描灰度值。

3.9 雙螢光素酶報(bào)告基因 使用miRanda靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫結(jié)合基因序列及功能，預(yù)測miR-330與EGR-2存在靶向結(jié)合序列。構(gòu)建野生型EGR-2 WT-3’UTR-螢光素酶表達(dá)載體和突變型EGR-2 Mut-3’UTR-螢光素酶表達(dá)載體，并將其和miR-330 inhibitor/mimic轉(zhuǎn)入細(xì)胞，孵育48 h。按照說明書進(jìn)行操作，使用螢光素酶報(bào)告基因檢測儀測定螢光素酶相對活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行分析。定量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。兩組資料和多組資料的比較分別采用雙側(cè)t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-330在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-330在胃癌組織表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖1A；與人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，miR-330在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá)(P<0.05)，其中在低分化的BGC-823細(xì)胞中表達(dá)最低(P<0.05)，中分化的SGC7901細(xì)胞表達(dá)次之(P<0.05)，高分化的AGS細(xì)胞表達(dá)再次之(P<0.05)，見圖1B。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-330在胃癌組織中的表達(dá)水平與年齡和性別無相關(guān)性；而與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和T分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表1。這些結(jié)果提示miR-330低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

Figure 1. The expression of miR-330 in the gastric cancer tissues and gastric cancer cells. A: the expression level of miR-330 in the gastric cancer and adjacent tissues (n=48); B: the expression of miR-330 in GES-1 cells and different gastric cancer cell lines (n=3). Mean±SD.**P<0.01vsgrastric cancer tissues;▲P<0.05vsGES-1 cells;#P<0.05vsAGS cells;△P<0.05vsSGC7901 cells.

圖1 miR-330在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2 miR-330表達(dá)對胃癌細(xì)胞生長的影響

檢測miR-330-i和miR-330-m在胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC-823轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果見圖2A。采用CCK-8法檢測miR-330表達(dá)對胃癌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor后，細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-330 mimic后，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，見圖2B，提示miR-330高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的生長。進(jìn)一步采用平板集落形成實(shí)驗(yàn)評估m(xù)iR-330在胃癌細(xì)胞生長的長期效應(yīng)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor后，細(xì)胞集落數(shù)升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-330 mimic后，細(xì)胞集落數(shù)降低(P<0.05)，見圖2C。

表1 miR-330表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

Figure 2. The effect of miR-330 on the growth of gastric cancer cells. A: the transfection efficiency of miR-330 inhibitor (miR-330-i) and miR-330 mimic (miR-330-m) in the SGC7901 cells; B: the viability of gastric cancer SGC7901 cells and BGC-823 cells after transfected with miR-330 inhibitor or miR-330 mimic deternimed by CCK-8 assay; C: the colony formation of gastric cancer SGC7901 cells and BGC-823 cells after transfected with miR-330 inhibitor or miR-330 mimic deternimed by plate colony formation assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC-i group;△P<0.05vsNC-m group.

圖2 miR-330對胃癌細(xì)胞生長的影響

3 miR-330表達(dá)對胃癌細(xì)胞遷移的影響

采用Transwell法檢測miR-330表達(dá)對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor后，細(xì)胞遷移數(shù)量顯著升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-330 mimic后，細(xì)胞遷移數(shù)量顯著降低(P<0.05)，見圖3。這提示miR-330高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。

4 EGR-2是miR-330的直接作用靶點(diǎn)

miRanda預(yù)測數(shù)據(jù)庫顯示miR-330與EGR-2的3’-UTR存在結(jié)合序列,圖4A。雙螢光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證EGR-2是miR-330的靶基因,見圖4B。同時，檢測到EGR-2的mRNA和蛋白在胃癌組織(圖4C、D)和胃癌細(xì)胞(圖4E、F)中低表達(dá)(P<0.05)。

Figure 3. The numbers of migratory gastric cancer cells after transfected with miR-330 inhibitor (miR-330-i) or miR-330 mimic (miR-330-m) deternimed by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC-i group;△P<0.05vsNC-m group.

圖3 Thanswell實(shí)驗(yàn)檢測miR-330對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 4.EGR-2gene was the direct target of miR-330. A: the 3’ UTR of EGR-2 mRNA had a putative binding site of miR-330; B: the relative luciferase activity of reporter plasmids carrying wild-type (WT) or mutant (Mut) EGR-2 3’UTR in the SGC7901 cells and BGC-823 cells co-transfected with miR-330 inhibitor (miR-330-i) or miR-330 mimic (miR-330-m); C and D: the mRNA and protein levels of EGR-2 in the gastric cancer tissues and adjacent tissues; E and F: the mRNA and protein levels of EGR-2 in the GES-1 cells and different gastric cancer cell lines. Mean±SD.n=3 in B, E and F;n=48 in C and D.&P<0.05vsNC-i group;@P<0.05vsNC-m group;▲P<0.05vsadjacent tissues;*P<0.05vsGES-1 cells;#P<0.05vsAGS cells;△P<0.05vsSGC7901 cells.

圖4 驗(yàn)證EGR-2基因?yàn)閙iR-330的直接靶基因

5 miR-330表達(dá)對EGR-2表達(dá)的影響

采用RT-qPCR和Western blot檢測miR-330表達(dá)對胃癌SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞EGR-2表達(dá)的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor后，胃癌SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞的EGR-2 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-330 mimic后，胃癌SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞的EGR-2 mRNA和蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The effect of miR-330 expression on EGR-2 expression. A and B: the expression of EGR-2 at mRNA and protein levels in the SGC7901 cells after transfected with miR-330 inhibitor (miR-330-i) or miR-330 mimic (miR-330-m); C and D: the expression of EGR-2 at mRNA and protein levels in the BGC-823 cells after transfected with miR-330 inhibitor or miR-330 mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC-i group;△P<0.05vsNC-m group.

圖5 miR-330表達(dá)對EGR-2表達(dá)的影響

6 用siRNA敲減EGR-2表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長與遷移

與miR-330-m+NC-siRNA組相比，miR-330-m+EGR-2-siRNA組胃癌細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),見圖6A，遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見圖6B。

討 論

近年來，研究表明眾多miRNAs參與調(diào)控胃癌的發(fā)生與進(jìn)展，但是miRNA的具體的分子機(jī)制研究尚未完善[11]。因此，對參與調(diào)控胃癌的miRNAs的進(jìn)一步功能鑒定以及具體機(jī)制的探討將會拓展對胃癌的診斷和治療。miR-330在不同類型腫瘤中有著顯著的表達(dá)差異[11-14]，這提示miR-330在不同腫瘤的異常表達(dá)具有一定的組織和細(xì)胞特異性，可能與細(xì)胞微環(huán)境有著密切的關(guān)系。這為研究miR-330在胃癌特異性表達(dá)和作用指明方向。本研究中采用RT-qPCR方法檢測到胃癌組織中miR-330在胃癌組織低表達(dá)；同時檢測到miR-330在胃癌細(xì)胞上低表達(dá)，且表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞分化程度有關(guān)，在低分化的BGC-823細(xì)胞上表達(dá)最低。進(jìn)一步通過病理特征分析發(fā)現(xiàn)，miR-330表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和T分期呈負(fù)相關(guān)，因此，推測miR-330可能與胃癌進(jìn)展相關(guān)。在SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor能促進(jìn)胃癌細(xì)胞活力、細(xì)胞集落形成和遷移能力，而轉(zhuǎn)染miR-330 mimic能抑制胃癌SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞的細(xì)胞活力、集落形成和遷移能力，提示miR-330在胃癌發(fā)揮抑癌基因的作用，可成為胃癌診斷和治療的一個潛在靶點(diǎn)。

Figure 6. Knock-down ofEGR-2expression by siRNA promoted the viability and migration ability of gastric cancer cells transfected with miR-330 mimic (miR-330-m). A: the effect of EGR-2-siRNA on the viability of gastric cancer SGC7901 cells and BGC-823 cells transfected with miR-330 mimic deternimed by CCK-8 assay; B: the effect of EGR-2-siRNA on the migration ability of gastric cancer cells transfected with miR-330 mimic deternimed by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-330-m+NC-siRNA group.

圖6 EGR-2-siRNA促進(jìn)miR-330 mimic轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞活力與遷移能力

另外，本研究檢測到EGR-2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞的mRNA和蛋白水平呈低表達(dá)，且胃癌SGC7901細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-330 inhibitor后，EGR-2 的mRNA和蛋白水平降低；胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-330 mimic后，EGR-2的mRNA和蛋白水平升高。EGR-2可反式調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[15-16]。比較直接的證據(jù)提示EGR-2在一些腫瘤細(xì)胞中對細(xì)胞的增殖和侵襲遷移起負(fù)調(diào)節(jié)作用[17]。EGR-2在骨肉瘤細(xì)胞低表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖[18]。近來有報(bào)道稱，EGR-2在胃癌組織低表達(dá)，過表達(dá)EGR-2可以抑制miR-17-5p表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移[19]。miRNAs通過調(diào)控靶基因mRNAs的翻譯來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[20]。為驗(yàn)證miR-330與EGR-2的關(guān)系，本研究通過miRanda預(yù)測靶基因軟件發(fā)現(xiàn)miR-330與EGR-2存在靶向結(jié)合片段，且已有研究在非小細(xì)胞肺癌證明了miR-330與EGR-2的靶向關(guān)系[21]，本研究進(jìn)一步采用雙螢光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證在胃癌細(xì)胞EGR-2是miR-330的靶基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EGR-2-siRNA能逆轉(zhuǎn)miR-330 mimic轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞的活力與遷移能力，說明miR-330調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生長和遷移是通過靶向調(diào)節(jié)靶基因EGR-2來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結(jié)合以往文獻(xiàn)提示miR-330通過促進(jìn)靶基因EGR-2的表達(dá)抑制胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。因此，我們的研究提示miR-330或許可以作為胃癌的一個診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。