王慶齡 ，裘鈞陶 ，詹越城 ，鐘世歡 ，楊 娜 ，何 斌 ，應(yīng)寒松

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009）

隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)越來越依賴于農(nóng)藥、抗生素和激素等外源物質(zhì)。農(nóng)藥殘留超標(biāo)會影響消費者食用安全，嚴(yán)重時會造成消費者致病、發(fā)育不正常，甚至直接導(dǎo)致中毒死亡。為了保障食品安全，嚴(yán)格監(jiān)督食品中的農(nóng)藥殘留，最為有效的方法之一是加強(qiáng)對食品中農(nóng)藥殘留檢測的力度。

蔬菜水果、茶葉和大米中克百威、滅多威、甲萘威、涕滅威、多菌靈、吡蟲啉、殺線威、啶蟲脒、吡蚜酮、氯吡脲、霜霉威、內(nèi)吸磷、殺蟲脒、啶酰菌胺、蟲酰肼、氰霜唑、氯噻啉、丁醚脲、噻螨酮、喹螨醚、噻蟲啉、苯胺靈、甲基硫菌靈、噻菌靈、苯酰菌胺、抑霉唑、戊唑醇、乙霉威、氟吡甲禾靈、噻蟲嗪、多效唑、二嗪磷、三唑酮和茚蟲威為常見的農(nóng)藥殘留[1-3]，是目前農(nóng)藥殘留檢測中要求的常見項目。但現(xiàn)行的相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)僅能檢測其中的幾項，不能同時進(jìn)行分析[4-10]，如GB/T 20770—2008僅能檢測34種里面的20種，GB/T 23584—2009僅能檢測34種里面的1種，N Y/T 1453—2007僅能檢測34種里面的7種，N Y/T 1720—2009僅能檢測34種里面的2種，GB 23200.34—2016僅能檢測34種里面的15種，SN/T 2560—2010僅能檢測34種里面的4種，GB/T 20769—2008僅能檢測34種里面的18種等[11]。因此在檢測過程中，如果需要檢測所有項目，則需要采用不同的方法，工作效率非常低，不利于快速檢測果蔬中的農(nóng)藥殘留，影響了果蔬在市場的流通。試驗建立同時測定34種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，為保證達(dá)到快速、準(zhǔn)確、可靠且簡便的目的，對預(yù)處理條件，包括提取溶劑、提取方式、凈化方式和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，提高檢測效率，降低基質(zhì)效應(yīng)，同時檢測多種農(nóng)藥殘留，以滿足國家對農(nóng)藥殘留監(jiān)控的要求。1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Series型超高效液相色譜儀（配備二元梯度泵，自動進(jìn)樣器，柱溫箱等）、Agilent 6460型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，USA公司產(chǎn)品；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；勻漿機(jī)，德國弗魯克公司產(chǎn)品；N-E V A PA 111型氮吹儀，美國O rganomation associates Inc公司產(chǎn)品；M illi-Q型純水儀，美國M illpore公司產(chǎn)品；GX-274AS PEC型多通道固相萃取系統(tǒng)，美國Gilson公司產(chǎn)品。除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、甲苯（色譜純），美國Tedia公司提供；甲酸（優(yōu)級純），上海安譜科科學(xué)儀器有限公司提供；冰乙酸、氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、N-丙基乙二胺吸附劑（P SA）、十八彎基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗洛里硅藻土，杭州化學(xué)試劑有限公司提供；克百威、滅多威、甲萘威、涕滅威、多菌靈、吡蟲啉、殺線威、啶蟲脒、吡蚜酮、氯吡脲、霜霉威、內(nèi)吸磷、殺蟲脒、啶酰菌胺、蟲酰肼、氰霜唑、氯噻啉、丁醚脲、噻螨酮、喹螨醚、噻蟲啉、苯胺靈、甲基硫菌靈、噻菌靈、苯酰菌胺、抑霉唑、戊唑醇、乙霉威、氟吡甲禾靈、噻蟲嗪、多效唑、二嗪磷、三唑酮、茚蟲威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量≥99%），D r.Ehrenstorfer公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:將上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各稱取0.01 g至10.00 mL容量瓶，甲醇溶解并定容，配制成約1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再用50%甲醇水溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

復(fù)合小柱（由上往下）:由900 mg無水硫酸鈉（分析純），150 mg十八彎基鍵合硅膠吸附劑（C18），150 mg N-丙基乙二胺吸附劑（P SA），150 mg弗洛里硅藻土組成。

1.2 試驗條件

1.2.1 樣品前處理

稱取蔬菜水果20.00 g于100 mL離心管中，加入40 mL乙腈，均質(zhì)機(jī)勻漿提取1 min后加入各2 g左右的無水M gS O4和NaCl，再次勻漿30 s后離心。

稱取大米或茶葉樣品5.00 g于100 mL離心管中，先加入10 mL水，浸潤30 min后再加入40 mL乙腈，均質(zhì)機(jī)勻漿提取1min后加入2 g左右的無水M gS O4和NaCl，再次勻漿30 s后離心。

1.2.2 樣品濃縮凈化

取上述離心后上清液10 mL到10 mL比直管中，于40℃條件下水浴氮吹至干，加入5.00 mL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻后過復(fù)合小柱后，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾后待測分析。

1.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜、質(zhì)譜條件

（1） 色譜條件。采用Agilent SB-C18型色譜柱（2.1×100 mm，1.8μm），柱溫35℃，進(jìn)樣體積5μL，流速0.3 mL/min，流動相A:0.1%甲酸水、流動相B:乙腈 =90～10∶10～90（體積比），梯度洗脫 0～3 min，A由90%變成50%；3～5 min，A由50%變?yōu)?0%；5～8 min時維持 A 為 10%；8～10 min，A 由10%變?yōu)?0%。

（2）質(zhì)譜條件。離子源:電噴霧離子源（ESI），掃描方式:正離子，檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測（M R M）方式采集，檢測器:Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀配有ESI離子源。

果蔬中34種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的質(zhì)譜條件見表1。

表1 果蔬中34種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的質(zhì)譜條件

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

為了充分提取出果蔬中的目標(biāo)物，根據(jù)氨基甲酸酯類的性質(zhì)并結(jié)合各種文獻(xiàn)資料所使用的提取劑，分別考查了乙腈、0.1%酸化乙腈、乙酸乙酯和丙酮作為樣品提取溶劑。

不同提取液測定結(jié)果見表2。

表2 不同提取液測定結(jié)果

由表2可知，用乙腈溶液作為樣品提取溶劑，極性較大、分子較小、提取能力較強(qiáng)，并將樣品中色素和一些弱極性物質(zhì)也被提取出來，試驗研究的農(nóng)藥物質(zhì)大部分都能被提取出來，所以可采用。0.1%酸化乙腈提取能力比乙腈弱一些，可能酸化過的乙腈對于個別弱酸性的物質(zhì)親和性更高，但是對于堿性物質(zhì)的提取不理想。而丙酮作為提取劑時，雖然其非極性較大，并能與水相溶的提取溶劑，能溶解大多數(shù)農(nóng)藥，且過濾和溶解都很容易，但又能大量提取植物組織中的油脂和色素，為下一步凈化帶來困難。乙酸乙酯提取效果跟乙腈相比，因為其選擇性更強(qiáng)，對一些水溶性的色素和有機(jī)酸糖類不會或者極少量提取，因此對弱極性農(nóng)藥的提取比較低。綜合考慮到與目標(biāo)物的溶解性和提取效率，選用乙腈溶液作為樣品的提取液。

2.2 使用固相萃取技術(shù)（S PE）富集凈化樣品

固相萃取（Solid Phase Extraction，S PE） 是利用固體附吸劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。S PE是一種柱色譜分離過程，分離機(jī)理、固定相和淋洗溶劑的選擇等都與高效液相色譜類似。由于它具有許多傳統(tǒng)樣品處理方法所不具有的優(yōu)點，因而受到分析工作者的重視，正在朝著多樣化、儀器化、標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展，在樣品預(yù)處理中發(fā)揮越來越重要的作用。由于蔬菜水果中的色素等雜質(zhì)對待測組分的離子化將產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，為了去除34種農(nóng)藥提取液中的其他雜質(zhì)，研究綜合了各種文章中涉及的NH2柱、C18柱、非多孔性炭黑小柱、硅膠柱、佛羅里硅藻土小柱、P SA粉末和自制的復(fù)合小柱，考查其凈化效果。

2.2.1 固相萃取小柱的選擇

根據(jù)固相萃取柱的基本特點及部分參考文獻(xiàn)，研究分別考查目前應(yīng)用較廣的W aters公司生產(chǎn)的Sep-P ark-C18， Sep-P ark-N， Sep-P ark-Silica， Sep-P ark-Florsi，Envi-Carb/GC-NH2預(yù)處理小柱，A O AC級別的P SA粉末以及自制的復(fù)合小柱，進(jìn)行了試驗，對空白樣品加標(biāo)（5.00μg/kg）進(jìn)行凈化。

不同S PE對回收率的影響見圖1。

圖1 不同S PE對回收率的影響

圖2 啶酰菌胺選擇離子色譜圖

圖3 丁醚脲選擇離子色譜圖

表3 水果和蔬菜中34種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的線性方程與線性系數(shù)

由圖1可看出，經(jīng)過6平行加標(biāo)，發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合小柱的回收率最高，可能原因34種農(nóng)藥種類比較復(fù)雜，其他6種柱子能對某一種或者某幾種物質(zhì)有凈化作用，而復(fù)合小柱能凈化大部分種類，吸附大部分雜質(zhì)，如色素、油脂和糖分，從而回收率比較高。

2.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

啶酰菌胺選擇離子色譜圖見圖2，丁醚脲選擇離子色譜圖見圖3，水果和蔬菜中34種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品的線性方程與線性系數(shù)見表3。

（1）以空白基質(zhì)溶液為溶劑，每種農(nóng)藥配置質(zhì)量濃度分別為 5.00，10.00，25.00，50.00，75.00，100.00 ng/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)工作液；接著將34種同樣質(zhì)量濃度的工作液混合，得到6份混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按質(zhì)量濃度由低到高進(jìn)樣體積為5μL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)行H PLC-M S/M S檢測，獲得34份農(nóng)藥的選擇離子色譜圖（例如圖2所示的啶酰菌胺選擇離子色譜圖，圖3所示的丁醚脲選擇離子色譜圖；為節(jié)省篇幅，其余農(nóng)藥的選擇離子色譜圖予以省略）。

（2） 每種農(nóng)藥以選擇離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，由儀器軟件繪制農(nóng)藥的物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由儀器軟件計算后，獲得物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程。并獲得線性相關(guān)系數(shù)R2值（由表3可知，34種物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999）。

2.3 方法回收率和精密度驗證

對不同陰性樣品（蘋果、黃瓜、大米、茶葉）分別進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)量為10.00 g/kg考查回收率。

34種農(nóng)藥殘留物質(zhì)在4種樣品中的平均添加回收率見表4。

表4 34種農(nóng)藥殘留物質(zhì)在4種樣品中的平均添加回收率/%

表4結(jié)果顯示，在4種食品基質(zhì)試驗中，黃瓜基質(zhì)的加標(biāo)回收率最高，蘋果、大米和茶葉基質(zhì)加標(biāo)回收率良好。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了蔬菜水果、茶葉大米中34種農(nóng)藥殘留含量的檢測方法，34種農(nóng)藥均在5～100 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其檢出限均能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的質(zhì)量濃度，并且回收率均在60%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也在10%以內(nèi)。因此，該方法適用于蔬菜水果、茶葉大米中34種農(nóng)藥殘留含量的測定，并具有快速高效、高靈敏等優(yōu)點。