黃慶斌

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建南平 353000）

0 引言

竹蓀（Dictyophora indusiata） 俗稱竹參、竹笙，鬼筆科竹蓀屬，是名貴的食用菌之一[1]，廣泛分布于我國福建、江西、云南等地。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹蓀多糖具有抗炎癥、降血壓、抗腫瘤等功效，對艾滋病亦有抑制作用，常作為原材料用于保健食品的制作中[2-4]。當(dāng)前，超聲波或微波已被單獨(dú)應(yīng)用于多種植物或真菌多糖的快速提取中，竹蓀多糖在提取時(shí)采用恒溫水浴提取法常配合其他輔助手段，然而采用超聲-微波聯(lián)合提取法對竹蓀多糖提取的研究報(bào)道較少。以往研究表明，提取時(shí)間、超聲功率、微波功率、料液比等4個(gè)因素對竹蓀多糖提取得率有影響[5]，以提取時(shí)間、超聲功率、微波功率、料液比為因素，探討各因素對竹蓀多糖提取工藝的影響，并通過L9（34）正交試驗(yàn)確定超聲-微波聯(lián)合提取竹蓀多糖的最佳工藝條件，為竹蓀多糖提取進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

竹蓀購于福建省南平市勝利市場。

無水乙醇、氯仿、正丁醇、氯化鈉均為分析純；D101型大孔吸附樹脂，南開大學(xué)化工廠提供，透析袋（分子量10 000 Da）購于北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

XH-300B型超聲波-微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；FZ102型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.2 竹蓀多糖提取基本工藝流程

竹蓀（干）→粉碎→過60目篩→竹蓀粉末（料液比為1∶40） →微波（基本參數(shù)160 W） →超聲（基本參數(shù)540 W）→水浴提?。ɑ緟?shù)水浴溫度80℃，水浴時(shí)間5 min） →以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心6 min取上清液→加等體積乙醇，4℃下過夜→以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心6 min獲得粗多糖沉淀→蒸餾水復(fù)溶→Sevag試劑除蛋白→以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心6 min得多糖沉淀→蒸餾水定容至100 mL測定其多糖含量→計(jì)算竹蓀多糖得率[6]。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

保持料液比、水浴溫度、超聲功率、微波功率等參數(shù)不變，選擇水浴時(shí)間2，3，4，5，6，7，8 min分別進(jìn)行竹蓀多糖提取，考查提取時(shí)間對多糖得率的影響。

1.3.2 超聲功率單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間、微波功率、料液比、水浴溫度等參數(shù)不變，選擇超聲功率分別為130，260，390，520，650，810，940 W進(jìn)行竹蓀多糖提取，考查超聲功率對多糖得率的影響。

1.3.3 微波功率單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間、超聲功率、料液比、水浴溫度等參數(shù)不變，選擇微波功率 50，80，110，140，170，200，230 W進(jìn)行竹蓀多糖提取，考查微波功率對多糖得率的影響。

1.3.4 料液比單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間、微波功率、微波功率、水浴溫度等參數(shù)不變，選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70（g∶mL） 分別進(jìn)行竹蓀多糖提取，考查料液比對多糖得率的影響。

1.4 正交試驗(yàn)方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)情況，選取合適的單因素參數(shù)水平進(jìn)行四因素三水平L（934）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.5 多糖含量測定

1.5.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確量取2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液定容于5 mL容量瓶中，將其分別稀釋成不同質(zhì)量濃度0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08 mg/L。用苯酚－硫酸法測定其吸光度，用同等體積的蒸餾水作空白對照，重復(fù)3次，取平均值。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=9.253 61X-0.027 2（R2=0.999 1），表明竹蓀多糖在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系[7]。

1.5.2 多糖含量的測定方法采用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對竹蓀多糖得率的影響

在超聲波功率520 W，超聲波頻率25 kHz，微波功率150 W，料液比1∶40條件下，研究提取時(shí)間從2～8 min（間隔1 min） 對竹蓀多糖得率的影響。

提取時(shí)間對竹蓀多糖得率的影響見圖1。

圖1 提取時(shí)間對竹蓀多糖得率的影響

提取時(shí)間是天然產(chǎn)物提取中需要考慮的影響因子，適宜的提取時(shí)間對得率和提取物的生物活性都可能產(chǎn)生顯著影響。由圖1可知，在2～5 min內(nèi)，竹蓀粗多糖得率從5.75%增加至12.25%，在U MAE體系中，時(shí)間的影響集中體現(xiàn)為微波-超聲波的綜合作用，隨著提取時(shí)間延長，在超聲波空化作用和微波熱效應(yīng)影響下，物料細(xì)胞快速破裂，多糖等有效成分被釋放出來，因此多糖得率快速增加，在5 min時(shí)得率達(dá)到最大值，得率在后期緩慢下降，可能是因?yàn)槲⒉ㄗ饔脤Χ嗵窃斐善茐亩苟嗵墙到?。微波的熱效?yīng)隨著提取時(shí)間繼續(xù)延長，可能對多糖的抗氧化活性產(chǎn)生不利影響。因此4～6 min是微波-超聲波聯(lián)合提取竹蓀多糖的適宜溫度。

2.1.2 超聲波功率對竹蓀多糖得率的影響

在提取時(shí)間5 min，超聲波頻率25 kHz，微波功率150 W，料液比1∶40條件下，研究超聲功率130，260，390，520，650，780，910 W對竹蓀多糖得率的影響。

超聲功率對竹蓀多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對竹蓀多糖得率的影響

超聲波的機(jī)械、溫?zé)?、理化效?yīng)可增加細(xì)胞膜通透性、升高體系溫度和細(xì)胞壁破碎作用等。由圖2可知，超聲功率從130 W增加至520 W，細(xì)胞壁破碎作用顯著增強(qiáng)，竹蓀多糖得率從7.02%增加至12.48%，當(dāng)超聲波功率繼續(xù)加大，竹蓀多糖得率趨于穩(wěn)定而不是出現(xiàn)明顯下降，這可能與不同提取方法對多糖物理穩(wěn)定性造成的影響有關(guān)。綜合考慮能耗問題，宜采用超聲功率400～600 W作為竹蓀多糖提取的超聲波功率。

2.1.3 微波功率對竹蓀多糖得率的影響

選用提取時(shí)間5 min，超聲功率520 W、超聲波頻率25 kHz，料液比1∶40條件下，研究微波功率50，80，110，140，170，200，230 W對竹蓀多糖得率的影響。

微波功率對竹蓀多糖得率的影響見圖3。

圖3 微波功率對竹蓀多糖得率的影響

微波輻射的高能作用和強(qiáng)穿透能力可以迅速到達(dá)物料細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行加熱，使得細(xì)胞膨脹破裂，內(nèi)容物流出加快；與此同時(shí)，多糖組分從物料內(nèi)部的擴(kuò)散速率隨微波產(chǎn)生的電磁場而加快。由圖3可知，在U MAE體系中，隨著微波功率的增加竹蓀多糖得率也在升高，微波功率從50 W增加至140 W時(shí)，竹蓀多糖得率從5.02%增加至12.08%，微波功率170 W時(shí)，竹蓀多糖得率達(dá)到最大值為12.15%，繼續(xù)增大功率，較強(qiáng)的微波作用會(huì)破壞竹蓀多糖的結(jié)構(gòu)，使竹蓀多糖降解，得率反而下降。因此，以微波功率140～160 W作為竹蓀提取的最優(yōu)微波功率范圍。2.1.4 料液比對竹蓀多糖得率的影響選用提取時(shí)間5 min，超聲功率520 W，超聲波頻率25 KHz，微波功率150 W，研究料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70 對竹蓀多糖得率的影響。

料液比對竹蓀多糖得率的影響見圖4。

圖4 料液比對竹蓀多糖得率的影響

提取液作為物料的分散介質(zhì)，適宜的料液比值對物料的分散程度、內(nèi)容物擴(kuò)散速率、微波加熱效果以及超聲波空化效果具有顯著影響。由圖4可知，當(dāng)料液比從1∶10增大至1∶40時(shí)，竹蓀多糖得率從8.02%增加至12.58%，當(dāng)料液比從1∶40增加至1∶70時(shí)，得率反而降至10.47%。一方面，過低的料液比不利于物料分散和水分滲透，導(dǎo)致較低的得率；另一方面，過高的水分含量可延緩微波的熱效應(yīng)、削弱超聲波的作用效果。料液比對自由基清除率的影響表現(xiàn)為與時(shí)間和微波功率相反的趨勢，隨著料液比升高，微波加熱效果被削弱，對抗氧化活性的破壞作用減小。綜合考慮，采用料液比1∶30～1∶50作為竹蓀多糖提取的適宜料液比范圍。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以竹蓀多糖得率為評價(jià)指標(biāo)，選用適當(dāng)水平，通過正交試驗(yàn)對竹蓀多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，提取時(shí)間（A）、超聲功率（B）、微波功率（C） 和料液比（D） 4個(gè)因素對竹蓀多糖提取得率影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，其提取的最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間4 min，超聲功率500 W，微波功率150 W，料液比1∶40（g∶mL），即A1B2C2D2，在此提取條件下，竹蓀多糖提取得率達(dá)到12.37%。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為驗(yàn)證竹蓀多糖提取的最優(yōu)條件準(zhǔn)確性，以微波功率150 W，超聲功率520 W，水浴提取時(shí)間5 min，料液比1∶40（g∶mL） 進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)（n=3），多糖得率分別為12.44%，12.52%，12.51%，平均得率12.49%，驗(yàn)證性試驗(yàn)數(shù)據(jù)高于正交試驗(yàn)9組結(jié)果，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

選取提取時(shí)間、超聲功率、微波功率、料液比4個(gè)因素通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以多糖提取得率為指標(biāo)，得出竹蓀多糖的最佳提取工藝為提取時(shí)間5 min，超聲功率520 W，微波功率150 W，料液比1∶40（g∶mL），在此優(yōu)化條件下，竹蓀多糖得率可達(dá)12.49%。