于 滔 曹士亮 張建國 扈光輝 王成波 曹靖生 劉寶民

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，哈爾濱150086；3農(nóng)業(yè)部東北北部玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150086）

玉米（Zea mays L．）是我國第一大糧食作物，2016年總產(chǎn)量高達(dá)2．2億t。近年來，隨著我國種業(yè)市場的快速發(fā)展，玉米種子作為我國種業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)品，其雜交種質(zhì)量的好壞直接影響玉米大田生產(chǎn)、新品種市場規(guī)模、種子企業(yè)及農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)效益[1]，玉米種子純度鑒定也已經(jīng)成為種子質(zhì)量檢測的核心指標(biāo)。因此，加強(qiáng)玉米種子純度鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化對于保證種子質(zhì)量、保護(hù)農(nóng)民利益、維護(hù)育種家權(quán)益等具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義[2]。目前，玉米種子純度鑒定已由傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定技術(shù)發(fā)展到分子標(biāo)記鑒定技術(shù)[3]，其中，SSR檢測技術(shù)因具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高和技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于玉米種子純度鑒定[4]。芯片毛細(xì)管電泳是在芯片上進(jìn)行的毛細(xì)管電泳，通過以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，使待測樣品在經(jīng)過玻璃、石英或各種聚合物材料制成的微米級(jí)通道時(shí)進(jìn)行高效分離及檢測，與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳相比，芯片毛細(xì)管電泳具備耗時(shí)短、通量高、系統(tǒng)體積小且易實(shí)現(xiàn)不同操作單元的集成等優(yōu)點(diǎn)[5]。本研究將SSR檢測技術(shù)與芯片毛細(xì)管電泳相結(jié)合，應(yīng)用于具有代表性的玉米品種先玉335和鄭單958的純度鑒定，為我國今后的玉米種子質(zhì)量鑒定和種業(yè)市場監(jiān)管提供方案支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料共6份，為雜交種先玉335及其親本自交系PH6WC、PH4CV和鄭單958及其親本自交系鄭58和昌7-2，研究所用玉米種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所保存且均為隨機(jī)抽樣所得。

1.2 供試材料基因組DNA提取 參考植物基因組DNA提取試劑盒（天根DP305）說明書分別提取供試材料葉片DNA，應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計(jì)（IMPLEN NanoPhotometer P-class）檢測玉米葉片DNA質(zhì)量及濃度。

1.3 SSR引物篩選 選擇農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT1432-2007玉米品種鑒定DNA指紋方法中20對基本核心引物其中的10對引物用于區(qū)分雜交種的父母本，引物由上海生工生物工程有限公司合成，具體信息見表1。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括DNA模板（50ng/μL）4．0μL，2×Mix 10．0μL，Left primer（10μmol/L）0．2μL，Right primer（10μmol/L）0．2μL，ddH2O 5．6μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5min，94℃變性 40s，60℃退火 35s，72℃延伸 45s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選親本間存在多態(tài)性SSR引物，染色采用EB替代物GelRed。

1.4 玉米種子純度鑒定 選用親本間多態(tài)性SSR引物分別對雜交種及其父本、母本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照LabChip GX Touch DNA 1K芯片說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行芯片毛細(xì)管電泳，使用LabChip GX Touch分析軟件對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并計(jì)算玉米種子純度=雜交種子數(shù)/檢測種子總量×100%。

表1 10對引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料DNA的質(zhì)量檢測 應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的先玉335、鄭單958、PH6WC、PH4CV、鄭58和昌7-2葉片DNA質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示，DNA條帶清晰無拖尾，說明所提取的DNA無降解，質(zhì)量較高。采用超微量分光光度計(jì)測量玉米葉片DNA純度，結(jié)果顯示所提DNA樣品 OD260/OD280比值均在 1．9～2．0 之間，說明本研究所制備的DNA純度符合試驗(yàn)要求，可以用于后續(xù)研究。

2.2 SSR引物篩選 選擇國準(zhǔn)NYT1432-2007基本核心引物中的10對SSR引物分別對PH6WC、PH4CV、鄭58、昌7-2 4份玉米自交系材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選親本間多態(tài)性引物，SSR引物篩選原則為該引物在父母本中的擴(kuò)增產(chǎn)物大小差異明顯，且電泳條帶盡量單一、清晰。5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2、圖3，根據(jù)引物篩選原則，選出適用于檢測雜交種先玉335的SSR引物為umc2105、bnlg2291，適用于檢測雜交種鄭單958的SSR引物為bnlg2291、bnlg161，鑒于bnlg2291引物在2組供試材料中均有較好的多態(tài)性，最終選擇bnlg2291引物用于后續(xù)研究。

圖1 玉米基因組DNA電泳檢測結(jié)果

圖2 PH6WC、PH4CV SSR引物篩選結(jié)果

圖3 鄭58、昌7-2 SSR引物篩選結(jié)果

2.3 供試材料的純度鑒定結(jié)果 選用SSR引物bnlg2291分別擴(kuò)增6份供試材料，其中雜交種先玉335和鄭單958各單獨(dú)提取94份葉片DNA用于PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行芯片毛細(xì)管電泳，并對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，若所獲得的峰圖為雙峰且均與bnlg2291引物在其父母本中篩選的峰值一致，則認(rèn)定為雜交種；若所獲得的峰圖為雙峰且只有1個(gè)峰值與bnlg2291引物在父母本中的峰值一致，則認(rèn)定為異交種；若所獲得的峰圖為雙峰但雙峰均與bnlg2291引物在父母本中的峰值不一致，則認(rèn)定為雜株；若所獲得的峰圖為單峰且峰值與bnlg2291引物在父母本中的1個(gè)峰值一致，則認(rèn)定為自交種。部分鑒定結(jié)果如圖4、圖5，玉米雜交種先玉335的純度為（94-2）/94×100%=97．87%，玉米雜交種鄭單958 的純度為（94-1）/94×100%=98．94%。

圖4 先玉335及其親本自交系芯片毛細(xì)管電泳純度鑒定部分結(jié)果

圖5 鄭單958及其親本自交系芯片毛細(xì)管電泳純度鑒定部分結(jié)果

3 結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記基序一般為1～6bp[6]，玉米基因組中含有大量的SSR多態(tài)性標(biāo)記，利用SSR分子標(biāo)記鑒定玉米種子純度，易于區(qū)分雜交種、自交種、異交種和雜株。但由于不同玉米品種間的純度鑒定引物存在差異，所以玉米種子純度鑒定前首先要篩選在雜交種雙親間存在多態(tài)性的SSR引物，通常選擇1對引物或2對以上引物組合[7-8]。在本研究中，采用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測SSR引物篩選結(jié)果，該方法分辨率雖然較聚丙烯酰胺凝膠電泳稍低，但能夠清楚區(qū)分差異大小20bp左右的片段，且操作簡單，大大降低試驗(yàn)成本及耗時(shí)，同時(shí)應(yīng)用無毒的EB替代物對環(huán)境及操作人員無危害。

芯片毛細(xì)管電泳原理基于微流體技術(shù)，分辨率可以達(dá)到1bp。與傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳相比，芯片毛細(xì)管電泳所需樣品量低于1μL檢測靈敏度能夠達(dá)到5pg/μL，樣品分析時(shí)間可短至42s，通量提高70倍，而且分離檢測過程全部由儀器自動(dòng)來完成，無人工介入，無交叉污染。與熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳相比，芯片毛細(xì)管電泳引物不需要熒光標(biāo)記，且可用的引物范圍較廣，適用于絕大多數(shù)SSR引物，因此試驗(yàn)成本更經(jīng)濟(jì)。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，芯片毛細(xì)管電泳根據(jù)峰值獲得的數(shù)值化數(shù)據(jù)更精確，后期數(shù)據(jù)分析更簡便，操作過程簡單，且通量高，全程無毒無害。

本研究選用玉米雜交種先玉335、鄭單958及其親本自交系PH6WC、PH4CV、鄭58和昌7-2作為試驗(yàn)材料，采用SSR檢測技術(shù)結(jié)合芯片毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，篩選出適用于鑒定先玉335和鄭單958種子純度的引物3對，應(yīng)用bnlg2291引物鑒定先玉335和鄭單958的純度分別為97．87%及98．94%。研究結(jié)果建立一套簡單、經(jīng)濟(jì)、高效、安全的玉米種子純度鑒定方法，為完善玉米種子純度快速鑒定方法提供參考。