竇曉霞，馬桂蘭，喬自林，王家敏，李 倬*

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010；3.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030）

MDCK細(xì)胞系是從美國一頭母曲架犬的腎臟組織分離培養(yǎng)獲得的細(xì)胞系，通常該細(xì)胞呈上皮樣以貼壁方式生長，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。許多研究表明MDCK細(xì)胞系可廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，尤其是對流感病毒的感染效率高、增殖快，且流感病毒不易變異的優(yōu)點(diǎn)，是目前被公認(rèn)的最適合流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系之一[1-4]。傳統(tǒng)的流感（禽流感）疫苗是由雞胚來繁殖病毒的，該技術(shù)雖然非常成熟，但它在疫苗需求激增時會出現(xiàn)生產(chǎn)能力不足的問題，特別是在應(yīng)對流感大流行時或暴發(fā)禽流感疫情時連雞胚供應(yīng)也存在困難，1995年，WHO就曾推薦使用傳代細(xì)胞來生產(chǎn)流感疫苗。近幾年，圍繞MDCK細(xì)胞系替代雞胚用于流感及禽流感病毒的監(jiān)測、研究及疫苗生產(chǎn)的研究均有了突破，為細(xì)胞基質(zhì)的新型流感疫苗的開發(fā)提供了理論和實(shí)踐支持，MDCK細(xì)胞為基質(zhì)的流感（禽流感）疫苗是大勢所趨[5-8]，我國各級政府也很支持基于MDCK細(xì)胞的流感（禽流感）疫苗的研究和生產(chǎn)。作者所在單位甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心（西北民族大學(xué)）于2014年從ATCC引進(jìn)了MDCK標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)凍存后進(jìn)行了復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，確定了引進(jìn)的細(xì)胞凍存復(fù)蘇效果良好，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代生長特性基本穩(wěn)定，可用于相關(guān)課題的研究。

1 材料與方法

1.1 MDCK細(xì)胞

（ATCC引進(jìn)，CCL-34TM，批號：60245139。引進(jìn)時細(xì)胞代次為55代，培養(yǎng)一代后凍存）；DMEM（高糖，Gibco，貨號：02-5062EJ，批號：1490890，由蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制成液體，配制批號：20140719，滲透壓319mOsmol/kg）；胎牛血清（FBS，蘭州民海生物工程有限公司生產(chǎn)，批號20140417）；胰蛋白酶（Gibco，貨號：27250，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司配制成0.25%胰蛋白酶溶液，配制批號：20140425，含EDTA-Na 0.3g/L）；顯微鏡（OLYMPUS，CKX-41）；CO2培養(yǎng)箱（ThermoFisher，3111）等。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇及活力測定

按常規(guī)方法復(fù)蘇MDCK細(xì)胞（P56），檢查細(xì)胞活力達(dá)到90%以上時，用10%FBS（體積百分比，下同）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃、5%CO2，下同）。

1.3 連續(xù)傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞生長至90%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1:4比例分瓶培養(yǎng)，連續(xù)傳代10代（P66）。

1.4 細(xì)胞生長曲線繪制

在P57、P59、P62和P66代繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4.1 細(xì)胞懸液的制備 取長成單層的待測細(xì)胞，用常規(guī)細(xì)胞消化方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。

1.4.2 稀釋 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，按有限稀釋法的原則，將細(xì)胞懸液稀釋至1×104個/ml。

1.4.3 接種及培養(yǎng) 將稀釋好的細(xì)胞懸液接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔1 ml。

1.4.4 計(jì)數(shù)及活力檢查 從接種培養(yǎng)起，每隔24 h，分別消化3孔的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.5 生長曲線繪制 以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長曲線圖。

1.5 細(xì)胞倍增時間計(jì)算

取細(xì)胞增長峰值前一次（96 h）所計(jì)得的細(xì)胞總數(shù)(Y)，接種細(xì)胞數(shù)（X）及生長時間（T）計(jì)算：倍增時間=T/A （式中：A=log2Y/X）。

1.6 細(xì)胞最大增殖濃度

細(xì)胞生長曲線的峰值即為細(xì)胞最大增殖濃度，P57代細(xì)胞在144 h細(xì)胞密度還未見降低，統(tǒng)計(jì)時按144 h的細(xì)胞密度為最大增殖濃度。

2 結(jié)果

凍存的MDCK復(fù)蘇活力為95.3%。MDCK細(xì)胞復(fù)蘇后第一代培養(yǎng)細(xì)胞生長較慢，可能細(xì)胞剛復(fù)活有適應(yīng)的過程，傳代一次后生長變快，按1:4分瓶子比例培養(yǎng)時，在48h就形成較致密單層，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞形態(tài)基本一致，如圖1。

圖1.MDCK細(xì)胞形態(tài)圖(48h,10X)（a.P57,b.P59,c.P62,d.P66）

P57生長曲線在48-144 h近直線，144 h細(xì)胞密度為107.6×104個/ml，還未出現(xiàn)下降的情況，倍增時間為15.8 h。P59、P62和P66細(xì)胞生長曲線成近“S”曲線，最達(dá)峰值均出現(xiàn)在120 h，分別105.5×104、97×104和102.4×104（個/ml），倍增時間分別為15、15.2和15.3（h），見圖2。

圖2.MDCK細(xì)胞生長曲線圖

3 結(jié)論

隨著生物制藥的快速發(fā)展，對生產(chǎn)用細(xì)胞系的要求越來越嚴(yán)格，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫建設(shè)就顯得尤其重要。ATCC是全球規(guī)模最大管理最規(guī)范和最有權(quán)威的細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)之一，為全世界的科研工作有償許可的提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株。每次從國外引進(jìn)細(xì)胞株的成本很高，引進(jìn)后首要的工作就是要進(jìn)行保種，為后期工作提供最原始的細(xì)胞種子。作者所在單位于2014年從ATCC引進(jìn)了MDCK細(xì)胞系，通過復(fù)蘇和連續(xù)傳代驗(yàn)證了保種的效果，初步證實(shí)了引進(jìn)和保種的細(xì)胞是可靠的。當(dāng)然， 確定一株細(xì)胞能否用于疫苗方面的研究，還要建立可持續(xù)使用數(shù)量足以維持?jǐn)?shù)年或數(shù)十年工作所需的主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，生產(chǎn)用的還要確定超高代次，要進(jìn)行更全面的細(xì)胞檢定，有的甚至送第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行，檢定的內(nèi)容主要包括遺傳特征、外源因子污染和致瘤性等方面，隨著研究工作的深入開展，這也是今后工作的重點(diǎn)。[9]