楊梅，夏耀雄，江波，王羽豐，劉坤

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院1干療科，2放療科，昆明 650106

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，中國直腸癌的發(fā)病率較高，并且約2/3的直腸癌患者為低位直腸癌，其中局部進(jìn)展期直腸癌占所有直腸癌的2/3[1]。根據(jù)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015版）[2]，局部進(jìn)展期直腸癌患者均需先行術(shù)前新輔助放化療，再行根治性手術(shù)治療。指南的建議基于數(shù)項大型隨機(jī)對照研究的Meta分析，但縱觀這些研究，均排除年齡＞75歲的直腸癌患者[3]。考慮老年人預(yù)期生存時間與腫瘤預(yù)期生存時間的關(guān)系，目前僅推薦對老年局部進(jìn)展期直腸癌患者采用個體化的放化療方案。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，越來越多的研究開始探討采用腫瘤分子標(biāo)志物預(yù)測直腸癌放化療的效果[4-8]，其中精準(zhǔn)預(yù)測老年局部進(jìn)展期直腸癌的放化療效果和預(yù)后更為重要。

目前，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在多種腫瘤組織中差異表達(dá)，在各種腫瘤的早期診斷、療效評價和預(yù)測預(yù)后方面已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究[5]。在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制研究中，已經(jīng)對生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（growth arrest specific 5，GAS5）[9]和 TINCR[10]等 lncRNA 進(jìn)行了初步探索，但目前尚缺乏關(guān)于局部進(jìn)展期直腸癌放化療無創(chuàng)性療效預(yù)測指標(biāo)（血清lncRNA）的研究。本研究首先分析老年直腸癌患者的血清lncRNA表達(dá)譜，篩選出潛在的預(yù)測新輔助放化療效果的差異lncRNA，從中選出了長基因間非蛋白編碼 RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626），探討LINC00626對直腸癌患者放化療效果和預(yù)后的預(yù)測價值，最后對LINC00626的靶基因進(jìn)行預(yù)測和信號通路分析，探索針對老年局部進(jìn)展期直腸癌患者療效和預(yù)后預(yù)測的新型無創(chuàng)腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院的6例老年局部進(jìn)展期直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為直腸腺癌；②年齡≥75歲；③經(jīng)術(shù)前影像學(xué)評價，腫瘤臨床T分期為cT3～4期和（或）淋巴結(jié)直徑大于1 cm；④完成放療聯(lián)合奧沙利鉑+卡培他濱（XELOX）方案化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②合并其他原發(fā)腫瘤或有其他惡性腫瘤史。根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1版[11]于放療結(jié)束后8周評估新輔助放化療的療效：3例反應(yīng)良好[完全緩解（complete response，CR）+部分緩解（partial response，PR）]，3例反應(yīng)不良[疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）+疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）]。分析反應(yīng)良好與反應(yīng)不良患者的血清lncRNA基因表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的lncRNA，其中第1位的基因為LINC00626。

根據(jù)上述納入排除標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步選取2013年2月至2014年2月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院的86例老年直腸癌患者，檢測其血清LINC00626水平，以3年總生存率為終點事件，運用x-tile軟件分析LINC00626表達(dá)水平的最佳分組截點為LINC00626相對表達(dá)量=5.1。將86例直腸癌患者分為LINC00626高表達(dá)組（LINC00626相對表達(dá)量≥5.1）18例與LINC00626低表達(dá)組（LINC00626相對表達(dá)值＜5.1）68例。LINC00626高表達(dá)組18例患者中，男8例，女10例；平均年齡為（86.1±4.9）歲。LINC00626低表達(dá)組68例患者中，男37例，女31例；平均年齡為（86.4±4.8）歲。

1.2 治療及療效評價方法

所有患者均進(jìn)行放療（40～50 Gy/20～25 f）聯(lián)合XELOX方案化療（奧沙利鉑130 mg/m2，d 1，卡培他濱850～1250 mg/m2，bid，d l～14）2個周期。

根據(jù)RECIST 1.1版[11]評估新輔助放化療的療效。CR：所有可測量的病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，至少持續(xù)4周；PR：所有可測量的病灶最長徑之和減少≥30%；SD：所有可測量的病灶最長徑之和減少＜30%或增加＜20%；PD：所有可測量的病灶最長徑之和增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶。

1.3 基因篩選

1.3.1 試劑和設(shè)備主要試劑和設(shè)備包括Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）、PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（購自日本Takara公司）、SYBR Premix ExTaqⅡKit試劑盒（購自日本Takara公司）、Agilent Human lncRNA Microarray 4×180 k芯片（購自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司）、NanoDrop 2000分光光度計（購自美國Applied Biosystems公司）、ABI 7500實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（購自美國ABI公司）。

1.3.2 篩選過程于治療前，清晨空腹抽取患者外周血4～5 ml加入離心管，4℃下以4000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)至1.5 ml離心管中，-80℃保存。按照Trizol試劑盒說明書提取血清樣本總RNA，測量RNA的濃度和純度。當(dāng)吸光度A260 nm/A280 nm為1.9～2.1時，進(jìn)行l(wèi)ncRNA芯片檢測。lncRNA芯片檢測由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成，共篩選出245個差異表達(dá)lncRNA，其中在反應(yīng)良好患者中的上調(diào)lncRNA有107個，下調(diào)lncRNA有138個。差異表達(dá)lncRNA的標(biāo)準(zhǔn)：反應(yīng)良好患者的lncRNA表達(dá)變化大于反應(yīng)不良患者的1.4倍以上（P＜0.05）。選取差異表達(dá)lncRNA中排列第1位的LINC00626基因。采用FunRich軟件[12]對LINC00626靶基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行信號通路分析。

1.4 qRT-PCR檢測

進(jìn)一步分析86例直腸癌患者的血清標(biāo)本。根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex-TaqⅡKit試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，提取RNA后，進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.5 隨訪及觀察指標(biāo)

術(shù)后2年內(nèi)，每3個月隨訪1次；術(shù)后第3年，每6個月隨訪1次。隨訪方式包括門診就診、電話隨訪。比較兩組患者的3年總生存率，及其與老年直腸癌患者性別、臨床分期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平、腫瘤下緣與肛緣的距離、療效的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank法比較兩組患者的生存率。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00626表達(dá)與臨床特征及療效的關(guān)系

LINC00626表達(dá)水平與老年直腸癌患者性別、臨床分期、CEA水平、腫瘤邊緣與肛緣的距離無關(guān)（P＞0.05）。LINC00626高表達(dá)組患者的CR率高于LINC00626低表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.372，P＜0.05）。（表1）

表1 LINC00626表達(dá)與老年直腸癌患者臨床特征及放化療療效的關(guān)系

2.2 3年總生存率的比較

LINC00626高表達(dá)組患者的3年總生存率為72.2%（13/18），明顯高于LINC00626低表達(dá)組患者的30.9%（21/68），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.318，P＜0.01）。（圖1）

圖1 LINC00626高表達(dá)組患者（n=18）與LINC00626低表達(dá)組患者（n=68）的生存曲線

2.3 LINC00626靶基因的信號通路分析

LINC00626靶基因主要富集于轉(zhuǎn)錄靶點△Np63亞型和Notch等信號通路。（圖2）

圖2 LINC00626靶基因的信號通路分析

3 討論

新輔助放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)是局部進(jìn)展期直腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[2]，但目前相關(guān)的前瞻性研究均基于年齡＜75歲的患者[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度的根治性治療方案（新輔助放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)）亦可以在老年（年齡≥70歲）直腸癌患者中獲得滿意的療效，安全性良好，但總體并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率均高于年輕（年齡＜70歲）患者[13]。此外，Shan等[14]發(fā)現(xiàn)，直腸癌患者的年齡與放化療的療效相關(guān)，年齡越大，放化療的療效越差。這些結(jié)果提示，對適合高強(qiáng)度治療方案的老年直腸癌患者進(jìn)行篩選非常重要，其中術(shù)前精準(zhǔn)地篩選適合新輔助放化療的老年直腸癌患者更為重要。

具有預(yù)后價值的lncRNA被不斷地研究，在多個腫瘤的臨床研究中已有一些小樣本的初步嘗試[15-17]。lncRNA作為非編碼RNA的一種，主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚不明確[15]。如BRAF激活長鏈非編碼RNA（BRAF activated long non-coding RNA，BANCR）、GAS5等lncRNA被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[16-17]。目前缺乏對無創(chuàng)（血清檢測）lncRNA應(yīng)用于老年直腸癌患者療效預(yù)測的嘗試。本研究首先通過對3例反應(yīng)良好老年直腸癌患者和3例反應(yīng)不良老年直腸癌患者的血清lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出LINC00626基因后，對86例老年直腸癌患者進(jìn)行進(jìn)一步研究，結(jié)果顯示LINC00626低表達(dá)組患者的3年總生存率為30.9%，低于LINC00626高表達(dá)組患者的72.2%，說明LINC00626具有預(yù)測預(yù)后的價值。本研究結(jié)果顯示，LINC00626的表達(dá)水平與放化療后的CR比例有關(guān)，提示LINC00626具有預(yù)測療效的價值。

目前尚缺乏關(guān)于LINC00626在腫瘤發(fā)生發(fā)展及放化療耐藥的相關(guān)機(jī)制研究。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測LINC00626的靶基因，并分析這些靶基因所在的信號通路。結(jié)果顯示，LINC00626的靶基因主要富集于轉(zhuǎn)錄靶點△Np63亞型和Notch等信號通路。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路上的HES1蛋白可以促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因（adenomatous polyposis coli，APC）相關(guān)基因，增加對5-氟尿嘧啶的抵抗。Zhang等[18]的體外研究提示，抑制Notch1/HES1可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對放療的敏感性。而LINC00626是否可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Notch1/HES1信號通路進(jìn)而影響老年直腸癌患者對放化療的敏感性及影響預(yù)后，值得進(jìn)一步探討，這為臨床耐藥靶點的設(shè)計提供了參考。

綜上所述，血清LINC00626可以作為老年局部進(jìn)展期直腸癌患者新輔助放化療療效預(yù)測的潛在、無創(chuàng)的腫瘤標(biāo)志物，與老年腫瘤局部進(jìn)展期直腸癌患者的預(yù)后有關(guān)。