王媛，惠雙，張成輝，郭宏強(qiáng)，賀海發(fā)，楊如玉

南陽市中心醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，3病理科，4南陽市血液腫瘤實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473000

2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450008

宮頸癌是全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，其進(jìn)展緩慢、轉(zhuǎn)移晚，臨床癥狀顯著，嚴(yán)重威脅女性患者的健康和生命。多數(shù)患者就診時(shí)的病灶相對(duì)局限，且預(yù)后較差，5年生存率較低[1-4]，因此，深入探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于宮頸癌的早期診斷、早期治療以及宮頸癌患者生存質(zhì)量的提高均具有重要的意義。GINS2蛋白（GINS complex subunit 2，GINS2）是含有兩個(gè)Ca2+EF-hand域和一個(gè)亮氨酸/異亮氨酸富集區(qū)的多功能蛋白，在多種外周組織中正常表達(dá)，在下丘腦核中表達(dá)并參與能量平衡等生物過程；此外，其配體在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)控、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用[5]，GINS2參與了胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、免疫和病毒感染等一系列生理活動(dòng)[6-7]。目前，關(guān)于GINS2的研究主要集中在肺癌、乳腺癌方面，而關(guān)于GINS2表達(dá)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究較少。因此，本研究通過探討宮頸癌組織中GINS2蛋白的表達(dá)與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在為宮頸癌患者的早期診斷和治療提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取

選取2011年3月至2015年1月南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科確診的98例宮頸癌患者的宮頸癌組織作為觀察組。宮頸癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①初中以上文化水平，且年齡≥18歲；②無精神障礙史，可自由交流和溝通；③接受化療≥2個(gè)療程；④均行血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、宮頸病理組織檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在心源性休克和永久性心臟內(nèi)傳導(dǎo)紊亂；②合并嚴(yán)重精神類疾??；③治療期間，同步接受其他腫瘤的化療；④存在其他嚴(yán)重疾病。98例宮頸癌患者的年齡為48～67歲，平均年齡為（57.5±4.8）歲；體重為50～63 kg,平均體重為（56.1±4.1）歲；HPV陽性65例，HPV陰性33例。采用2012年版國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行病理分期：Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期46例；病理類型：鱗癌85例，腺癌13例。選取同期24例健康體檢者的正常宮頸組織作為對(duì)照組。健康體檢者的年齡為50～68歲，平均年齡為（59.2±4.0）歲；體重為50～61 kg，平均體重為（55.3±3.1）kg。兩組受試者的年齡和體重比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。全部患者及家屬均對(duì)本研究知情同意并自愿簽署知情同意書，且本研究經(jīng)過南陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批通過。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 GINS 2蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)分別稱取0.1 g正常宮頸組織和宮頸癌組織，采用微波粉碎器將宮頸組織碾磨成粉末狀，將其轉(zhuǎn)入2 ml無菌管中，加入1.5 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.4），充分振蕩混勻，4 ℃靜止2 h，以4500 r/min離心20 min，離心半徑為5 cm，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunoadsordent assay，ELISA）試劑盒（購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）檢測(cè)GINS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 GINS 2蛋白陽性表達(dá)情況檢測(cè)及結(jié)果判定采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)GINS2蛋白在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)情況。制作常規(guī)5 μm厚的石蠟切片，3%過氧化氫溶液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，微波修復(fù)抗原，PBS常規(guī)沖洗，1%GINS2抗體工作液（購于英國Abcam公司），4 ℃過夜，加入二抗IgG（稀釋濃度為1∶1000），室溫孵育30 min，加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度水化，封片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），采用雙盲法評(píng)估GINS2蛋白的陽性表達(dá)情況。GINS2蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；兩種評(píng)分相加，最終結(jié)果0～1分為陰性（-）；2分為弱陽性（+）；3～4分為強(qiáng)陽性（++）；5～7分為極強(qiáng)陽性（+++）。本研究將陰性和弱陽性歸為陰性表達(dá)，強(qiáng)陽性和極強(qiáng)陽性歸為陽性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)及隨訪

比較宮頸癌組織和正常宮頸組織中GINS2蛋白的表達(dá)情況，分析GINS2蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。采用電話隨訪的方式對(duì)宮頸癌患者的生存情況進(jìn)行隨訪，隨訪起始日期為術(shù)后第1天，隨訪截止日期為2018年1月1日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Epidata錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GINS 2蛋白的表達(dá)情況

宮頸癌組織中GINS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（2.28±0.15）ng/g，明顯高于正常宮頸組織的（0.78±0.12）ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.506，P＜0.01）。宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達(dá)率為79.6%（78/98），明顯高于正常宮頸組織的4.2%（1/24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=63.186，P＜0.01）（圖1）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS 2蛋白的表達(dá)情況

圖1 宮頸癌組織（n=98）和正常宮頸組織（n=24）中GINS 2蛋白的陽性表達(dá)情況（二氨基聯(lián)苯胺法染色，×400）

不同年齡宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同病理類型、組織分化程度、TMN分期、浸潤(rùn)深度、淋巴血管間隙浸潤(rùn)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者GINS 2蛋白的表達(dá)情況（n=98）

2.3 宮頸癌組織中GINS 2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，宮頸癌組織中GINS2蛋白陽性表達(dá)患者失訪18例，死亡44例；GINS2蛋白陰性表達(dá)患者失訪5例，死亡1例。GINS2蛋白陰性表達(dá)患者的3年生存率為70.0%（14/20），高于GINS2陽性表達(dá)患者的20.5%（16/78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.206，P＜0.05）。GINS2蛋白陰性表達(dá)患者的生存期為（27.5±5.98）個(gè)月，長(zhǎng)于GINS2蛋白陽性表達(dá)患者的（13.8±6.43）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.369，P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中GINS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01），說明GINS2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平較高。國外研究顯示，GINS2蛋白對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，其具有時(shí)間、空間表達(dá)的特異性；若藥物沉默GINS2蛋白表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能得到有效的抑制[5,7,9]。結(jié)合本次研究結(jié)果，提示GINS2蛋白可能成為宮頸癌治療的分子靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中GINS2蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織（P＜0.01）。不同病理分型、組織分化程度、TMN分期、浸潤(rùn)深度、淋巴血管間隙浸潤(rùn)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者的宮頸癌組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明高表達(dá)的GINS2蛋白能夠促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。GINS2蛋白在對(duì)啟動(dòng)細(xì)胞的增殖具有重要的作用，并能抑制細(xì)胞的凋亡[10]。高表達(dá)GINS2蛋白的腫瘤細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞的能力更強(qiáng)，而腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞僅有緊密結(jié)合才能夠穿過細(xì)胞外基質(zhì)層，建立轉(zhuǎn)移灶GINS2蛋白可介導(dǎo)細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移和趨化性，并激活淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞上相應(yīng)的趨化因子受體，因此，高表達(dá)GINS2蛋白的腫瘤細(xì)胞在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。這與本研究結(jié)果中GINS2蛋白能夠促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展的結(jié)果相符合。本研究中，GINS2蛋白陰性表達(dá)患者的3年生存率高于GINS2陽性表達(dá)患者，3年生存期長(zhǎng)于GINS2蛋白陽性表達(dá)患者（P＜0.05），提示GINS2低表達(dá)能夠抑制腫瘤的發(fā)展，使患者獲得較好的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，GINS2能夠調(diào)控BAX/Blc的表達(dá)水平，從而對(duì)細(xì)胞凋亡起到調(diào)控作用，具體表現(xiàn)為誘導(dǎo)Bcl-2高表達(dá)，形成異源二聚體BAX/BAX，從而抑制細(xì)胞凋亡[10]。

綜上所述，GINS2蛋白在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量和陽性表達(dá)率均較高，其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起促進(jìn)作用；GINS2蛋白低表達(dá)的宮頸癌患者能夠獲得較好的預(yù)后。由于本研究納入的樣本量較少，因此不可避免地存在選擇偏倚，在本研究的下個(gè)階段將擴(kuò)大樣本量，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討GINS2蛋白與宮頸癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。