楊 澤， 馮佳麗， 張 宏, 馬玉涵*， 趙 巖

(1. 安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2. 中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031)

奶粉是一種常見的乳制品,富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。奶粉中的脂肪含量是乳制品研究的重點(diǎn)之一,也是奶粉中的主要成分之一。相關(guān)研究顯示，41種奶粉的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.06%,在中老年和嬰幼兒奶粉中含量最高,接近30%,而在女士奶粉及脫脂奶粉中含量較低,最低僅1.2%。在嬰幼兒配方奶粉中,脂肪具有重要作用:(1)提供了40%～50%嬰兒生長發(fā)育和維持健康需要的能量;(2)是脂肪酸的主要來源,構(gòu)成機(jī)體的重要成分;(3)是脂溶性營養(yǎng)的重要載體[2]。

對(duì)奶粉營養(yǎng)物質(zhì)的檢測(cè)主要基于化學(xué)測(cè)定法,但其存在一定的弊端。如化學(xué)試劑使用會(huì)污染環(huán)境,檢測(cè)往往需要比較復(fù)雜昂貴的檢測(cè)儀器(凱氏定氮儀、高效液相色譜儀、原子吸收分光光度計(jì)等),檢測(cè)費(fèi)用和時(shí)間成本較高等[3]。除此之外,以間接產(chǎn)物為目標(biāo)的檢測(cè)方法會(huì)為不法分子摻假提供便利,比如此前引發(fā)了重大食品安全問題的三聚氰胺事件就是由于凱氏定氮法在檢測(cè)中存在的漏洞所致[4]。

傅里葉變換中紅外(FTIR)光譜具有檢測(cè)速度快、操作簡便、適合于高通量多種成分的快速分析,并具有指紋特征,可以對(duì)備選成分有效檢測(cè)的同時(shí)對(duì)非法添加的成分進(jìn)行判斷識(shí)別。因此,FTIR光譜廣泛應(yīng)用于化學(xué)、材料科學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品科學(xué)領(lǐng)域[5]。紅外光譜可分為近紅外(1 333-4 000 cm-1)、中紅外區(qū)(400-4 000 cm-1)和遠(yuǎn)紅外區(qū)(10-400 cm-1)3個(gè)譜段[6]。大多數(shù)有機(jī)化合物和無機(jī)離子的基頻振動(dòng)吸收都落在中紅外區(qū)內(nèi)。因?yàn)榛衔锓肿又兴幕瘜W(xué)鍵或官能團(tuán)不同,或者官能團(tuán)所處的化學(xué)環(huán)境不同,所以振動(dòng)能級(jí)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所需能量不同,因而會(huì)吸收不同波長的紅外光,形成不同的紅外光譜圖[7]。FTIR光譜可以實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)某些特定基團(tuán)的鑒定和指認(rèn),其吸收峰峰高(峰面積)與該基團(tuán)的濃度成正比例關(guān)系,符合朗伯-比爾定律。因此,也可以利用FTIR光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析[8]?；诖死碚摰淖钪饕椒ň褪俏辗宸甯?峰面積)定量法[9]。但是這種定量關(guān)系存在一定的問題,最主要的就是對(duì)于復(fù)雜的多組分體系,FTIR光譜峰位往往會(huì)疊加,互相干擾,給定量分析造成不便[10]。

為解決這些問題，一種方法是對(duì)復(fù)雜體系的FTIR光譜進(jìn)行分峰擬合,將一個(gè)寬峰經(jīng)過變換,獲得更為精細(xì)的峰位信息[11]。另一種方法是基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法。隨著計(jì)算機(jī)計(jì)算能力的提升,對(duì)大量光譜進(jìn)行矩陣分析成為可能,也產(chǎn)生了多種算法實(shí)現(xiàn)對(duì)光譜的定量分析。其中應(yīng)用最廣的是偏最小二乘法(PLS)[12]。本試驗(yàn)利用光譜特征峰位法和PLS法對(duì)奶粉的脂肪含量進(jìn)行定量分析,以分析二者在FTIR光譜定量分析方面的優(yōu)劣,并將二者結(jié)合起來,以期獲得更為高效穩(wěn)定的定量分析模型。

1 材料與方法

1.1 供試材料

對(duì)市售的41種奶粉進(jìn)行FTIR光譜分析,其中的奶粉包含了全脂奶粉、脫脂奶粉、高蛋白奶粉、高鈣奶粉、中老年奶粉、嬰幼兒奶粉等各個(gè)品類,脂肪含量呈現(xiàn)明顯的梯度變化(表1)。

1.2 奶粉脂肪含量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照GB 5413.3-2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪的測(cè)定》中蓋勃乳脂計(jì)方法測(cè)定[13]。

1.3 試驗(yàn)方法

采用奶粉稀釋氟化鈣薄膜法,將各奶粉樣品加蒸餾水充分溶解后,調(diào)整濃度為40 mg/mL,取15 μL滴加到CaF2紅外光譜窗片上,40 ℃干燥過夜,將載有樣品的CaF2紅外光譜窗片上光譜儀檢測(cè)。所用光譜儀為Perkin Elmer公司的Spectrum GX傅里葉變換紅外光譜儀,DTGS檢測(cè)器,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)累加32 次。

表1 試驗(yàn)所用奶粉品牌及脂肪含量

1.4 FTIR光譜擬合

利用Peakfit 4進(jìn)行特征峰區(qū)擬合;去卷積處理(Deconvolution);基線類型:Linear,D2;峰位類型:Gauss Amp;可變寬度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

FTIR光譜利用OPUS 7.0軟件進(jìn)行基線校正、矢量歸一化和PLS定量模型構(gòu)建;線性回歸利用IBM SPSS 19計(jì)算分析;Origin Pro 2016繪圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉的FTIR光譜圖

奶粉的FTIR光譜如圖1所示,特征性峰位的歸屬見表2。其中脂肪的特征性峰位為2 925、2 855、1 745 cm-1。

圖1 奶粉的FTIR光譜圖

波數(shù)/cm-1基團(tuán)歸屬 3 800～3 200O-H伸縮振動(dòng)糖的吸收峰 2 925CH2的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)(主要來源于脂肪) 2 854CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)(主要來源于脂肪) 1 745C=O伸縮振動(dòng)(主要來源于脂肪) 1 651酰胺I帶C=O吸收峰(主要來源于蛋白質(zhì)) 1 543酰胺II帶的N-H和C-N吸收峰(主要來源于蛋白質(zhì)) 1 456CH2/CH3彎曲振動(dòng)(脂肪、蛋白質(zhì)) 1 200～1 030C-O伸縮振動(dòng) 930～900環(huán)振動(dòng)

2.2 奶粉脂肪FTIR光譜特征性峰位的確定

通過對(duì)普通奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉、嬰兒奶粉FTIR光譜分析,我們發(fā)現(xiàn),奶粉脂肪含量在2 925、2 855、1 745 cm-1峰位有顯著差異,上述峰位在25號(hào)嬰兒配方奶粉>7號(hào)伊利全脂奶粉>1號(hào)完達(dá)山益生元中老年奶粉>5號(hào)完達(dá)山脫脂奶粉(圖2)。此結(jié)果證實(shí)了表2結(jié)論,并體現(xiàn)出上述峰位峰高與脂肪含量之間似乎存在劑量依賴關(guān)系。

圖2 普通奶粉、全脂奶粉、脫脂奶粉和嬰兒奶粉的FTIR光譜比較

2.3 奶粉FTIR光譜脂肪特征性峰的峰高和峰面積擬合計(jì)算結(jié)果

為對(duì)此劑量依賴關(guān)系進(jìn)行定量分析判斷,對(duì)41種奶粉FTIR光譜進(jìn)行峰位擬合處理,以1號(hào)完達(dá)山益生元中老年奶粉為例,其峰區(qū)擬合結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示,脂肪含量與2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的積分面積和峰高均存在相關(guān)性,且各峰峰高和峰面積之間也存在相關(guān)性(P<0.001)(表3),其線性回歸分析方程結(jié)果如所示。

圖3 完達(dá)山益生元中老年奶粉FTIR光譜2 750～3 000 cm-1和1 500～1 800 cm-1光譜擬合圖

脂肪含量2 925 cm-1峰面積2 925 cm-1峰值2 855 cm-1峰面積2 855 cm-1峰值1 745 cm-1峰面積1 745 cm-1峰值 脂肪含量 2 925 cm-1峰面積0.749?? 2 925 cm-1峰值0.815??0.985?? 2 855 cm-1峰面積0.762??0.947??0.950?? 2 855 cm-1峰值0.799??0.981??0.993??0.962?? 1 745 cm-1峰面積0.725??0.848??0.881??0.8080.862?? 1 745 cm-1峰值0.818??0.948??0.989??0.942??0.988??0.873??

Fat Content=6.937+14.975×Area1 745+6.661×Area2 855-6.29×Area2 925

(回歸方程1)

Fat Content=6.979+1 054.486×Height1 745-419.825×Height2 855+104.62×Height2 925

(回歸方程2)

(回歸方程1)R=0.83,R2=0.688 3;(回歸方程2)R=0.831,R2=0.688 5。

以上述公式計(jì)算的奶粉脂肪含量計(jì)算值和真值(表1)比較,其對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖4所示?？梢钥闯?雖然脂肪含量與2 925、2 855、1 745cm-1峰位的積分面積和峰高存在較強(qiáng)的相關(guān)性,但通過簡單的線性回歸獲得的方程1和2計(jì)算值與真實(shí)值之間仍存在著比較明顯的差距。說明僅僅以特征峰位法構(gòu)建奶粉的脂肪含量方程效果不甚理想。

圖4 由線性回歸公式獲得的奶粉脂肪含量計(jì)算值和真值對(duì)應(yīng)圖(a)峰積分面積;(b)峰高

2.4 奶粉FTIR光譜脂肪含量PLS定量自動(dòng)優(yōu)化模型

為改善FTIR光譜定量分析效果,嘗試?yán)没瘜W(xué)計(jì)量學(xué)手段,以O(shè)PUS軟件的自動(dòng)優(yōu)化功能,獲得的PLS法構(gòu)建脂肪含量的定量模型,結(jié)果如圖5所示。從此圖可以看出,定量模型的R2=0.943,RMSECV=1.71,RPD=3.88,維數(shù)=10。雖然獲得了較高的R2值和較低的RMSECV結(jié)果,但從RMSECV/維數(shù)結(jié)果可以看出,該模型很不穩(wěn)定,在樣本擴(kuò)大的情況下可能會(huì)造成定量誤差增大。該定量模型的光譜范圍為(3 689.33～376.9)+(3 070.32～757.8)+(2 449.32～138.8)+(1 521.6～900.6) cm-1,范圍分散,說明該自動(dòng)優(yōu)化模型沒有能夠特異性的選擇與脂肪相關(guān)的特異性峰位,造成了定量模型維數(shù)的過飽和現(xiàn)象。

圖5 奶粉脂肪含量FTIR自動(dòng)優(yōu)化定量模型

2.5 基于奶粉脂肪特征峰位的FTIR光譜脂肪含量定量分析模型

為改善定量分析模型的分析效果,避免光譜范圍選擇的過飽和現(xiàn)象,我們以脂肪特征性的2 925、2 855、1 745 cm-1峰位作為備選峰位,經(jīng)過優(yōu)化,獲得了新的定量分析模型。所選用的光譜范圍為(2 997-2 781)+(1 795.5-960.4) cm-1,預(yù)處理方式為一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正。校正集計(jì)算結(jié)果如圖6所示。從上圖可以看出,定量模型的R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,維數(shù)=6,其RMSECV/維數(shù)呈現(xiàn)平滑下降曲線,模型穩(wěn)定,分析效果理想。

圖6 奶粉脂肪含量FTIR定量模型

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)有的檢測(cè)奶粉脂肪的方法包括羅茲·哥特里法、索氏提取法、巴布考克法、蓋勃氏乳脂計(jì)測(cè)量法、色譜技術(shù)等[15]。但上述方法實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,儀器設(shè)備昂貴,實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)環(huán)境會(huì)造成污染,不適應(yīng)常規(guī)快速高通量的質(zhì)檢檢測(cè),光譜分析技術(shù)可以有效避免上述缺陷,是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的適宜方法[16]。常用用于乳制品定性和定量分析的光譜技術(shù)包括中紅外光譜和近紅外光譜[15-17]。

中紅外光譜特征性峰位特征明顯,以往主要用于物質(zhì)的鑒定和定性分析,但最近隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和化學(xué)計(jì)量學(xué)的進(jìn)步,開展了越來越多的定量分析嘗試。主要包括兩大類,第一類是對(duì)特征性峰區(qū)面積、峰高等根據(jù)朗伯-比爾定律進(jìn)行回歸分析,例如楊妮娜等[18]利用特征性峰面積方法對(duì)傣藥燈臺(tái)葉中藥用成分含量進(jìn)行測(cè)定,朱亞明等[19]用分峰擬合法定量分析精制煤瀝青熱轉(zhuǎn)化過程的結(jié)構(gòu)變化等。第二類是利用化學(xué)計(jì)量學(xué)手段,采用PLS、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、主成分分析、支持向量機(jī)等方法對(duì)中紅外光譜進(jìn)行定量分析。例如吳迪等[15]利用LS-SVM方法對(duì)奶粉脂肪含量予以分析,趙巖等[20]利用PLS方法對(duì)酸奶中的營養(yǎng)成分加以定量等。二者在定量方法和原理上存在一定的差異,本文對(duì)兩種方法進(jìn)行比較后結(jié)合使用,為奶粉脂肪的FTIR光譜定量分析方法的優(yōu)化做了嘗試。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,脂肪含量與2 925、2 855、1 745 cm-1峰位的積分面積和峰高存在較高的相關(guān)性,其相關(guān)系數(shù)均大于0.7,且上述峰高和峰面積之間也存在共線性關(guān)系。利用此峰高和峰面積獲得了2個(gè)回歸方程,這兩個(gè)回歸方程的R=0.832,R2=0.688 3和R=0.831,R2=0.688 5。說明該回歸方程能夠?qū)δ谭壑竞孔鲞m當(dāng)?shù)亩ㄐ耘袛?但尚無法達(dá)到合理的定量判斷能力。這說明對(duì)于奶粉這樣的復(fù)雜體系而言,單純依靠特征峰的面積或者峰高尚無法得到非?？煽康亩磕Ｐ汀恼嬷岛陀?jì)算值的對(duì)應(yīng)關(guān)系來看,該公式對(duì)脂肪含量較高的奶粉預(yù)測(cè)效果較差。這提示有些脂肪信息未得到有效提取,需要對(duì)光譜范圍適當(dāng)擴(kuò)展。

但過寬的光譜范圍也可能對(duì)定量計(jì)算結(jié)果造成不利影響。雖然吳迪等對(duì)奶粉脂肪含量的中紅外光譜全譜范圍(4 000-400 cm-1)以LS-SVM構(gòu)建定量模型,其維數(shù)為8,R2=0.955 6,RMSECV=1.666 8[15]。但本研究發(fā)現(xiàn),如果對(duì)全譜范圍以PLS構(gòu)建定量模型,其R2=0.642 8,RMSECV=4.12,其RMSECV/維數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定,尚不及線性回歸方程計(jì)算效果。

利用OPUS軟件自帶的自動(dòng)優(yōu)化功能,所獲得的定量分析模型雖然有較高的R2值,較低的RMSECV結(jié)果,但選定的維數(shù)過高,選擇維數(shù)過飽和,模型不夠穩(wěn)定。而以脂肪的特征性峰位為基礎(chǔ),優(yōu)化獲得的定量分析模型有更低的維數(shù),更加穩(wěn)定的分析效果,其R2=0.931,RMSECV=1.69,RPD=4.01,維數(shù)=6,可以對(duì)奶粉的脂肪含量做比較準(zhǔn)確的定量分析。