連國(guó)亮 陳 東 商建峰 李彥瑋 李 倩

對(duì)于有胸腔積液的患者， 常常要抽出積液做細(xì)胞學(xué)檢查， 以證實(shí)是否有惡性腫瘤細(xì)胞。在常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷中常用直接離心涂片法。但實(shí)際應(yīng)用中，筆者發(fā)現(xiàn)涂片法存在涂片厚、細(xì)胞重疊、結(jié)構(gòu)不清、細(xì)胞量少而陽(yáng)性檢出率低等缺點(diǎn)。特別是對(duì)細(xì)胞形態(tài)不典型的間皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的鑒別僅用直接離心涂片法是難以勝任的，常需做免疫組織化學(xué)染色檢查才能確診[1～3]。但是直接用涂片做免疫組織化學(xué)染色時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)背景深、非特異性著色、陽(yáng)性不可靠等缺點(diǎn)[4]。近年來(lái)細(xì)胞蠟塊制作的普及已經(jīng)可以彌補(bǔ)胸腔積液直接涂片不足，但是細(xì)胞蠟塊的制作步驟繁多，受操作人員技術(shù)限制，細(xì)胞量可能不能滿足診斷工作的需要，因此選取筆者所在科室2015～2017年住院患者胸腔積液298例，其中產(chǎn)生凝集物的標(biāo)本105例，采用胸腔積液涂片與細(xì)胞蠟塊及凝集物切片聯(lián)合檢查，凝集物診斷價(jià)值可取代復(fù)雜的細(xì)胞蠟塊制作，取得了較滿意的效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.一般資料：筆者所在科室2015～2017年住院患者胸腔積液(298例)產(chǎn)生凝集物的標(biāo)本(105例)，其中男性標(biāo)本64例，女性標(biāo)本41例。標(biāo)本呈深黃色渾濁、淺黃色渾濁、血性，并有膠凍狀懸浮狀態(tài)的凝集物。臨床診斷惡性腫瘤胸腔積液88例，胸腔積液原因待查17例。

2.試劑和儀器：CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等免疫組織化學(xué)試劑購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)公司，HE染色套裝購(gòu)自格林環(huán)保試劑公司，10%中性甲醛溶液購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)，95%乙醇購(gòu)自北京通廣精細(xì)化學(xué)。Leica Bond-MAX全自動(dòng)免疫組織化學(xué)工作站，萊卡染色封片機(jī)。

3.細(xì)胞涂片制作方法：取胸腔積液30ml，2500r/min，離心5min，棄上清，取沉淀物在載玻片上采用推拉法進(jìn)行制片，陰干至不能見(jiàn)明確水分后在95%乙醇內(nèi)固定15min，然后進(jìn)行HE染色。

4.細(xì)胞蠟塊的制作：取胸腔積液100ml分裝在兩個(gè)離心管中，2500r/min，離心5min，棄上清，分別取沉淀物放入10ml軟離心管中并加入10%中性甲醛溶液，混勻，2500r/min，離心5min，靜置20min。棄上清，加入95%乙醇，混勻，2500r/min，離心5min，靜置20min后，定型后可得到圓形細(xì)胞塊，進(jìn)行脫水處理。

5.凝集物的收集：用鑷子夾取胸腔積液中的凝集物，進(jìn)行取材，脫水。

6.染色方法：將細(xì)胞塊和凝集物包埋、切片后，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等染色。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，兩組間計(jì)量資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)， 相關(guān)性分析以Pearson相關(guān)系數(shù)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

105例臨床送檢有凝集物的胸腔積液標(biāo)本其中采用細(xì)胞涂片方法可診斷惡性腫瘤84例，其中5例判斷不清，16例非腫瘤性間皮增生。采用細(xì)胞蠟塊及凝集物制作蠟塊的方法均可診斷惡性腫瘤88例，17例非腫瘤性間皮增生，二者診斷結(jié)果完全一致。

凝集物制作蠟塊與細(xì)胞涂片比較顯示，細(xì)胞量豐富，HE染色色彩鮮艷、胞質(zhì)、核仁清晰，詳見(jiàn)圖1、圖2。

凝集物蠟塊與細(xì)胞蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì),兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果完全一致。詳見(jiàn)圖3～圖6。腫瘤脫落細(xì)胞診斷結(jié)果詳見(jiàn)表1，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果詳見(jiàn)表2。

討 論

隨著先進(jìn)的細(xì)胞制備技術(shù)的發(fā)展，在常規(guī)的胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查中，采用的方法是將胸腔積液離心，棄去上清液和凝塊物，取沉渣涂片2 張，鏡檢，許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)摒棄細(xì)胞蠟塊技術(shù)，在筆者看來(lái)此種忽視并非合理。細(xì)胞蠟塊技術(shù)應(yīng)當(dāng)用于處理細(xì)胞學(xué)制備完成后的所有殘留物質(zhì)。這些物質(zhì)常常是包含有價(jià)值的診斷證據(jù)和不能被細(xì)胞學(xué)技術(shù)所處理的組織碎片。Richardson等研究顯示，如果用殘留物質(zhì)的細(xì)胞塊切片補(bǔ)充涂片技術(shù)，那么有5%的液體標(biāo)本可額外診斷出癌癥[5，6]。

圖1 細(xì)胞涂片(HE染色)A.×10;B.×40

圖2 凝集物蠟塊(HE染色)A.×10;B.×40

圖3 凝集物蠟塊(calretinin,×40)

圖4 凝集物蠟塊(p40,×40)

圖5 凝集物蠟塊(p63,×40)

圖6 凝集物蠟塊(TTF-1,×10)

表1 105例胸腔積液細(xì)胞涂片、細(xì)胞蠟塊與胸腔積液凝集物HE染色診斷結(jié)果比較(n)

組織活檢n惡性腫瘤腺癌(n)鱗癌(n)非腫瘤間皮細(xì)胞無(wú)法判斷細(xì)胞涂片1055628165細(xì)胞蠟塊 1055830170腔腔積液凝集物1055830170

表2 陽(yáng)性細(xì)胞檢出率、著色強(qiáng)度及背景著色的檢測(cè)結(jié)果

一個(gè)原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的重要診斷標(biāo)志是會(huì)出現(xiàn)血色或淡紅色滲出液，而滲出液以較高的蛋白含量(通常高于30g/L)為特征，富含纖維蛋白質(zhì)，靜置易于凝固，人們認(rèn)為它是由纖維蛋白組成，不利于作細(xì)胞學(xué)涂片，所以凝塊物被棄去，但是滲出液中包含各種不同但有診斷價(jià)值的細(xì)胞團(tuán)被凝集物包裹、吸附。

筆者選取懸浮狀態(tài)的凝集物，比重接近胸腔積液，其成分還有待于繼續(xù)研究，凝集沉淀于瓶底凝集物經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其大多為血小板凝集產(chǎn)物，吸附或包裹細(xì)胞極少，所以不能采用。含有懸浮狀態(tài)凝集物的胸腔積液占總體送檢胸腔積液的35.23%，采取替代細(xì)胞蠟塊制作可提高工作效率，降低人員勞動(dòng)強(qiáng)度。

細(xì)胞涂片做免疫細(xì)胞染色時(shí)可能出現(xiàn)如下情況：①由于經(jīng)過(guò)95%乙醇固定，對(duì)可能損失某些抗原；②組織內(nèi)含有H2O2酶，在洗滌的時(shí)候可造成脫片；③細(xì)胞比較分散，耗費(fèi)試劑，而且容易出現(xiàn)邊緣現(xiàn)象。當(dāng)面對(duì)含有凝集物的胸腔積液時(shí)，傳統(tǒng)細(xì)胞蠟塊制作步驟繁多，受操作人員技術(shù)限制，獲得細(xì)胞量可能不能滿足診斷需要。筆者將凝集物直接包埋，脫水，不受技術(shù)員操作的影響，并且獲得豐富的細(xì)胞量，組織抗原保持完整，細(xì)胞集中。

胸腔積液凝集物包埋切片法收集到的有核細(xì)胞多、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，與細(xì)胞涂片相結(jié)合，大大提高了細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性檢出率，對(duì)細(xì)胞量較少的標(biāo)本，意義更大。用胸腔積液凝集物做免疫組織化學(xué)染色，可連續(xù)切片，有利于多種抗體組合運(yùn)用或?qū)δ骋惶囟?xì)胞的比較觀察，陽(yáng)性顆粒為棕黃色，定位準(zhǔn)確可靠、背景清、可重復(fù)性高，提高了疑難病例診斷的準(zhǔn)確率[4]。

據(jù)細(xì)胞涂片HE染色對(duì)惡性腫瘤及疑似腫瘤和間皮細(xì)胞做以下免疫組織化學(xué)染色，鈣結(jié)合蛋白染色，間皮瘤有表達(dá)，在間皮瘤與肺腺癌的診斷中具有一定的價(jià)值，而腺癌極少表達(dá)(9.8%)[7，8]。本研究中1例腺癌細(xì)胞蠟塊及凝集物蠟塊均表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果。細(xì)胞角蛋白(CK)染色可作為上皮源性腫瘤的重要標(biāo)志物，但不能完全區(qū)分腺癌與間皮瘤。波形蛋白(vimentin)染色是間葉源性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，因此可用于區(qū)分腺癌與間皮瘤[9，10]。肺腺癌免疫組化通常CK7、Napsin A和TTF-1 均呈陽(yáng)性[11～15]。肺鱗癌免疫組化標(biāo)記CK、p40、CK5/6、p63均呈陽(yáng)性[16]。筆者應(yīng)用一組抗體進(jìn)行檢測(cè)比較，不僅提高了診斷的陽(yáng)性率，而且對(duì)腺癌和惡性間皮瘤起到鑒別診斷作用。同時(shí)胸腔積液中增生或退變的間皮細(xì)胞與某些惡性細(xì)胞尤其是腺癌細(xì)胞在形態(tài)上易于混淆，給診斷帶來(lái)困難。將免疫組織化學(xué)用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷，結(jié)果直觀，較易判斷[17～19]。

胸腔積液凝集物制作蠟塊的方法簡(jiǎn)單，與細(xì)胞涂片相結(jié)合，對(duì)于組織脫落細(xì)胞良惡性很好鑒別， 使診斷結(jié)果準(zhǔn)確可靠，防止漏診、誤診，為臨床治療提供明確依據(jù)[20]。胸腔積液凝集物制作成的蠟塊，可以提供樣本結(jié)構(gòu)性的信息，還可以用作免疫組織化學(xué)和特殊染色以及分子檢測(cè)。所以沒(méi)有任何理由丟棄胸腔積液中的凝集物，這樣可以以最低的代價(jià)獲得后續(xù)輔助研究的理想對(duì)象。對(duì)于含有懸浮凝集物的胸腔積液標(biāo)本，完全可以用凝集物替代細(xì)胞蠟塊的制作。