楊金輝 胡海龍 孫建濤 郝彤彤 李小輝 張 寒

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率呈逐年上升趨勢，然而其確切的發(fā)病機制尚不明確[1]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個nt的不具有編碼蛋白功能的RNA，具有組織特異性[2]。lncRNA參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等方面有關(guān)，近年的研究成果表明lncRNA與多種惡性腫瘤的形成密切相關(guān)[3]。越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[4]。ERVH48-1是一個全新的lncRNA，在疾病特別是腫瘤中少有報道。本研究通過檢測ERVH48-1在膀胱癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平，觀察ERVH48-1與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。選取表達(dá)水平最低的膀胱癌細(xì)胞，向細(xì)胞株內(nèi)轉(zhuǎn)染ERVH48-1質(zhì)粒，觀察細(xì)胞株增殖、遷移和下游基因表達(dá)的改變，探討ERVH48-1對膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和可能的作用機制。

材料與方法

1.材料:選取筆者醫(yī)院泌尿外科2017年2月～2017年11月收治的膀胱癌患者16例，所有患者術(shù)前均未接受過化學(xué)治療、放射治療、生物免疫治療，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理證實，本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。膀胱癌細(xì)胞(BIU87、T24、5637、UM-UC-3)和正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。長鏈非編碼RNA ERVH48-1 質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自美國康寧公司。熒光定量 PCR 試劑盒和噻唑藍(lán)(methyl thiazol tetrazolium，MTT)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司。ECL顯影液購自美國Thermo公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自武漢博士德生物有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞BIU87、T24和5637，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1。在轉(zhuǎn)染前1天，將5637細(xì)胞使用不含雙抗的培養(yǎng)基重懸后接種到6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染ERVH48-1質(zhì)粒(實驗組)和陰性對照質(zhì)粒(對照組)，lncRNA的終濃度為15nmol/L。18h后吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

3.熒光實時定量PCR檢測 ERVH48-1、TCF21 mRNA的表達(dá)量:采用TRIzol法提取組織和細(xì)胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用熒光定量PCR試劑盒檢測組織和細(xì)胞中ERVH48-1或TCF21 mRNA 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件為：94℃ 10min、60℃ 1min、72℃ 1min，35個循環(huán)。實時定量PCR引物序列詳見表1，每個樣品設(shè)置4個復(fù)孔，檢測得到的熒光信號值采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 實時定量PCR引物序列

4.MTT法檢測高表達(dá)ERVH48-1對5637細(xì)胞增殖能力的影響:實驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)染ERVH48-1質(zhì)粒，對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，24h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度重鋪至96孔板(4000個/孔)，每組設(shè)置4個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)5天。在每天的檢測時間點，每孔分別加入20μl MTT試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100μl二甲基亞砜，96孔板在搖床上振蕩15min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔在490nm波長處的吸光度(A)值，繪制生長曲線。

5.Transwell實驗檢測高表達(dá)ERVH48-1對5637細(xì)胞遷移能力的影響:轉(zhuǎn)染48h后消化收集各組5637細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入上室，下室內(nèi)加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)18h后。使用PBS溶液清洗Transwell小室，使用95%甲醇固定20min，使用0.3%結(jié)晶紫染液染色20min，使用PBS溶液清洗，使用棉簽擦去未穿過濾膜的細(xì)胞。顯微鏡計數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞，以4個視野的細(xì)胞平均數(shù)為準(zhǔn)。

6.Western blot法檢測高表達(dá)ERVH48-1對5637細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:轉(zhuǎn)染48h后消化收集各組5637細(xì)胞，使用PBS溶液洗滌細(xì)胞，提取總蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)膜電至PVDF膜上。各組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下使用含5%牛血清白蛋白的封閉液封閉3h，4℃下分別與一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin孵育過夜，洗膜后室溫下與二抗孵育3h，洗膜后滴加ECL顯影液顯影。

結(jié) 果

1.膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1的表達(dá)量:膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1的表達(dá)量分別為1.65±0.23和5.41±0.40，膀胱癌組織中ERVH48-1表達(dá)量明顯低于癌旁組織(P<0.01，圖1)。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1表達(dá)水平檢測與癌旁組織比較，*P<0.01

2.膀胱癌細(xì)胞和正常膀胱上皮細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)量：與SV-HUC-1正常膀胱上皮細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞中的ERVH48-1表達(dá)量明顯降低，膀胱癌細(xì)胞BIU87、T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1中ERVH48-1的表達(dá)量分別為0.60±0.04、0.36±0.04、0.17±0.03、0.78±0.02和1.01±0.07，膀胱癌細(xì)胞株中ERVH48-1表達(dá)量均低于正常膀胱上皮細(xì)胞(P<0.05)。其中5637細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)水平最低(P<0.01，圖2)。

圖2 正常膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中ERVH48-1表達(dá)水平檢測與SV-HUC-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.各組5637細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)量:轉(zhuǎn)染48h后收集各組5637細(xì)胞，對照組和實驗組5637細(xì)胞中ERVH48-1表達(dá)量分別為1.01±0.06和6.27±0.44，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)，ERVH48-1質(zhì)粒使細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)明顯增加(圖3)。

圖3 實驗組和對照組5637細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)量與對照組比較，*P<0.01

4.高表達(dá)ERVH48-1抑制5637細(xì)胞的增殖能力：通過MTT法連續(xù)5天檢測各組5637細(xì)胞的增殖能力，以時間(天)為橫軸、吸光度(A)值為縱軸繪制生長曲線。與對照組比較，從第3天起，實驗組細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制(P<0.05，圖4)。

圖4 MTT檢測各組膀胱癌細(xì)胞增殖能力與對照組比較，*P<0.05

5.高表達(dá)ERVH48-1抑制5637細(xì)胞的遷移能力：Transwell實驗檢測各組5637細(xì)胞的遷移能力。實驗組和對照組5637細(xì)胞穿過濾膜細(xì)胞數(shù)分別為69.74 ± 17.95和192.20 ± 27.56，表明ERVH48-1能夠抑制5637細(xì)胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Transwell實驗檢測ERVH48-1對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響與對照組比較，*P<0.01

6.高表達(dá)ERVH48-1促進(jìn)膀胱癌5637細(xì)胞中TCF21 mRNA的表達(dá):熒光實時定量PCR檢測各組5637細(xì)胞TCF21 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，實驗組和對照組5637細(xì)胞TCF21 mRNA的表達(dá)分別為9.97±0.74和1.01±0.06， ERVH48-1能夠促進(jìn)TCF21 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

7.高表達(dá)ERVH48-1對膀胱癌5637細(xì)胞下游蛋白表達(dá)的影響:Western blot法檢測各組5637細(xì)胞下游蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示高表達(dá)ERVH48-1誘導(dǎo)TCF21蛋白表達(dá)升高，TCF21蛋白表達(dá)升高引起細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表達(dá)明顯降低，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin表達(dá)明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測ERVH48-1下游蛋白表達(dá)水平

討 論

長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，廣泛分布于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)[5]。lncRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平通過多種方式如加帽、加尾、選擇性剪接促進(jìn)或抑制下游基因的表達(dá)[6]。近年來研究表明，大量lncRNA在正常組織和腫瘤組織中存在異常的差異性表達(dá)，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著抑癌作用[7]。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中受到很多l(xiāng)ncRNA的調(diào)控，MALAT1、XIST可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，HULC、DUXAP10、SNHG16可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖[8～12]。目前有關(guān)長鏈非編碼RNA ERVH48-1在腫瘤中的作用未見報道。

本研究通過檢測ERVH48-1在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ERVH48-1在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞株中表達(dá)水平下調(diào)，提示ERVH48-1可能在膀胱癌中發(fā)揮類似抑癌基因的作用。本研究通過轉(zhuǎn)染實驗證明了高表達(dá)ERVH48-1能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，說明ERVH48-1可能通過抑制增殖和遷移調(diào)控膀胱癌的形成，這對于揭示膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展機制具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子21(TCF21)基因定位于6q23-q24，是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[13]。TCF21在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、腎癌等中表達(dá)明顯下調(diào)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，且與患者的低生存率明顯相關(guān)[14～16]。有研究顯示，TCF21在膀胱癌中的表達(dá)水平明顯降低[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)膀胱癌細(xì)胞中ERVH48-1的表達(dá)后，TCF21基因在mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高。TCF21蛋白表達(dá)升高后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表達(dá)明顯降低，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin表達(dá)明顯降低，與細(xì)胞功能實驗結(jié)果一致。長鏈非編碼RNA ERVH48-1調(diào)控TCF21基因的分子機制和信號通路是本研究下一步研究的重點。

綜上所述，長鏈非編碼RNA ERVH48-1在膀胱癌中低表達(dá)。高表達(dá)ERVH48-1可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，其作用機制可能通過促進(jìn)抑癌基因TCF21的表達(dá)。ERVH48-1可能為膀胱癌的診治提供新的治療靶標(biāo)和分子標(biāo)志物。