李雪君 邵冬華 何美琳 梁國威

甲胎蛋白(AFP)是目前原發(fā)性肝癌廣泛使用的腫瘤標志物[1]。然而僅有60%的肝癌患者在初診時血清AFP水平升高，其不升高原因未明。研究顯示，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是AFP基因表達的限速步驟[2]。AFP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控包括啟動子，3個獨立增強子和2個沉默子[3]。在遺傳性持續(xù)高AFP血癥(HPAFP)家族中的研究顯示，AFP基因啟動子上2個肝細胞核因子1A(HNF1A)結(jié)合位點的點突變是非疾病性高AFP血癥的原因[4]。然而，是否HNF1A或其他AFP表達調(diào)控因子基因突變也與血清AFP水平相關(guān)，目前未見文獻報道。

筆者選擇AFP基因啟動子表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子HNF1A、肝細胞核因子1B(HNF1B)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白A(C/EBPA)基因，以及沉默子區(qū)調(diào)控因子鋅指和同源框蛋白2(ZHX2)基因作為研究靶點，優(yōu)先選擇最小等位基因頻率(MAF)>5%的外顯子錯義突變(1000基因組數(shù)據(jù)庫)，或者已經(jīng)有研究表明與某些性狀或疾病相關(guān)的SNP位點作為研究對象，在1010例中國漢族健康成人中，探討HNF1A-rs1169288(A/C，Ile27Leu)和rs2464196(G/A，Ser487Asn)、HNF1B-rs4430796(A/G)、C/EBPA-rs34529039(C/A)和ZHX2-rs7844465(G/T)與血清AFP水平相關(guān)性[3～5]。

對象與方法

1.研究對象:2017年1～11月在筆者醫(yī)院招募了1010例年齡在25～65歲的健康漢族受試者，其中男性615例，女性395例。符合以下任意標準的受試者被剔除：急性或慢性病毒性肝炎感染[乙型肝炎病毒表面抗原和(或)丙型肝炎病毒抗體檢測陽性]，男性飲酒量≥140克/周或女性≥70克/周，妊娠，肝癌和其他惡性腫瘤。從每個受試者獲得書面知情同意書。整個研究符合赫爾辛基宣言并獲得筆者醫(yī)院倫理學委員會批準。

2.方法：記錄并測量所有受試者的年齡、性別、身高、體重，并計算體重指數(shù)(BMI)。收縮壓和舒張壓取3次靜息水平測量的平均值。

采用美國Philips公司(IU-22型)B型超聲影像儀行腹部B型超聲來診斷脂肪肝[6]。

采集空腹靜脈血，4h檢測完畢。使用AU 2700自動化學分析儀(日本Olympus公司)測量丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。 通過免疫比濁法測定(美國Dade Behring公司)CRP水平。 血清AFP水平通過美國雅培公司i2000免疫分析儀測定，其批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為3.5%～4.7%和4.1%～8.1%。由美國雅培公司提供配套試劑、標準品和質(zhì)控品。

3.外周血基因組DNA提?。喊凑罩圃焐痰臉藴什僮鞑襟E，使用DNA分離試劑盒(中國天根生化科技有限公司)從EDTA抗凝保存的200μl全血樣品中提取基因組DNA。 提取后的基因組DNA立即在-80℃保存。

4.SNP位點選擇及分型：SNP位點選擇標準：優(yōu)先選擇最小等位基因頻率(MAF)>5%的外顯子錯義突變(1000基因組數(shù)據(jù)庫)，或者已經(jīng)有研究表明與某些性狀或疾病相關(guān)。共挑選了5個SNP作為研究目標，包括HNF1A-rs2464196、rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465(表1)。

采用等位基因特異性引物結(jié)合TaqMan探針的熒光定量PCR的方法學(ARMS-TaqMan法)進行檢測[7]。根據(jù)ΔCt值(ΔCt=野生型等位基因反應的Ct值減去突變型等位基因反應的Ct值)進行分型。PCR試劑使用Tiangen Real Master Mix(Probe)試劑盒(中國天根生化科技有限公司)。使用Primer Premier 5.0軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計引物和探針，并由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。在所有等位基因特異性引物3′末端-2位置設(shè)計一個額外的錯配，以加強等位基因特異性區(qū)分。使用ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行檢測。反應體系為20μl，每種成分的體積(終濃度)如下：上、下游引物各1μl(0.25μmol/L)，TaqMan探針1μl(0.25μmol/L)，2×real-master mix 8μl，增強溶液1μl，ddH2O 6μl，DNA模板2μl。除rs34529039外，所有其他反應的條件均為95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。 Rs34529039的反應條件為97℃ 2min，97℃ 15s， 62℃ 1min，50個循環(huán)。在1010例受試者中，這5個SNP位點的基因分型成功率均為100%。為了驗證基因分型的準確性，筆者通過直接測序(中國賽百盛基因技術(shù)有限公司)對30個隨機樣品進行重新測定，兩個測試結(jié)果之間一致性達到100%。

表1 SNP位點ARMS-TaqMan分型法的引物和探針

引物3′端的下劃線斜體堿基是錯配堿基，以增加等位基因鑒別的特異性

結(jié) 果

1.1010例研究對象的基礎(chǔ)資料及SNP位點分布頻率:在1010例健康漢族受試者中，男性和女性之間年齡、LDL-C以及AFP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。男性BMI、收縮壓、舒張壓、AST、ALT、GGT、TG、CRP、FPG以及脂肪肝水平均顯著高于女性(P<0.05)，而HDL-C和TC水平顯著低于女性(P<0.05)。

基于每個SNP位點的基因型分別將1010例研究受試者分為3組(表2)。 在所有受試者中，rs2464196-A、rs1169288-C、rs4430796-G、rs34529039-A和rs7844465-T的最小等位基因頻率分別為0.479、0.453、0.292、0.007和0.199。男性和女性之間各SNP的等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 所有5個SNP位點的等位基因頻率在總體或不同性別組中均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

P值代表男性、女性性別組間比較

2.不同SNP位點基因型血清AFP水平的變化:如圖1所示，HNF1A-rs2464196 GG、GA和AA基因型之間血清AFP水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。rs2464196-AA基因型的平均血清AFP水平為3.60±1.59ng/ml(最低)，AG型為3.92±1.78ng/ml(中間)，GG型為4.21±2.10ng/ml(最高)。3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P值為0.000～0.042)。與rs2464196-GG基因型比較，攜帶AA和GA+AA基因型的平均血清AFP水平分別下降了14.5%(P=0.000)和9.5%(P=0.001)。HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465與血清AFP水平之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 5個SNP位點各基因型血清AFP水平比較誤差條形圖表示根據(jù)SNP位點基因型分層的血清AFP水平，P值為AFP水平進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行組間比較

3.rs2464196等位基因型與血清AFP水平的相關(guān)性分析:如表3所示，以AFP水平作為因變量，不同模型的線性回歸分析顯示，在無協(xié)變量(模型1，P=0.000)，或調(diào)整年齡、性別和BMI(模型2，P=0.000)，或調(diào)整年齡、性別、BMI、血壓、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝的情況下， 均顯示HNF1A-rs2464196等位基因是血清AFP水平變化的獨立影響因素(模型3，P=0.000)。

表3 rs2464196等位基因型與血清AFP水平的相關(guān)性

模型1.無協(xié)變量；模型2.控制年齡、性別和BMI；模型3.控制年齡、性別、BMI、血壓、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝

討 論

本研究首次探討了AFP基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子常見SNP與血清AFP水平的相關(guān)性。 研究結(jié)果顯示，HNF1A-rs2464196基因多態(tài)性與中國漢族健康成人的血清AFP水平密切相關(guān)，這種相關(guān)性不受年齡、性別、BMI、血壓、血脂指標、肝功指標、炎性指標以及脂肪肝的影響。攜帶rs2464196-A等位基因的個體可能使它們更傾向于表現(xiàn)為低AFP水平。與攜帶GG等位基因型的人群AFP水平比較，攜帶rs2464196-AA等位基因型者的AFP水平降低了14.5%，GA+AA型攜帶者降低了9.5%。另外，HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465與血清AFP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義。

HNF1A位于染色體12q24.31上，主要在肝臟中表達，已經(jīng)在100多種基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了HNF1A潛在的結(jié)合位點[8]。HNF1A在AFP基因表達的調(diào)控中起關(guān)鍵作用?；A(chǔ)研究顯示AFP基因啟動子上遠端HNF1A結(jié)合區(qū)的點突變可以使AFP表達活性降低約65%，而近端HNF1A結(jié)合區(qū)點突變可以降低50% AFP表達活性[9]。有研究報道HNF1A基因突變與CRP、LDL-C、HDL-C以及妊娠期糖尿病相關(guān)[10～12]。

HNF1A由631個氨基酸組成，包含3個功能結(jié)構(gòu)域：①二聚體結(jié)構(gòu)域(氨基酸1～33);②DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包含特異性DNA識別所需的區(qū)域(氨基酸100～184)和同源結(jié)構(gòu)域(氨基酸198～281);③反式激活結(jié)構(gòu)域(氨基酸282～631)[13]。rs1169288基因多態(tài)性位于HNF1A的二聚體結(jié)構(gòu)域，這個區(qū)域?qū)τ贒NA的結(jié)合是必需的。因此筆者推測rs1169288基因多態(tài)性可能會影響HNF1A蛋白結(jié)合AFP基因的能力，從而影響AFP基因表達。然而，筆者的結(jié)果顯示rs1169288基因多態(tài)性與血清AFP水平無顯著相關(guān)。rs2464196位于HNF1A的反式激活結(jié)構(gòu)域，即rs2464196突變可能影響與AFP基因表達相關(guān)的反式調(diào)節(jié)作用。筆者的結(jié)果顯示rs2464196多態(tài)性與血清AFP水平顯著相關(guān)，表明rs2464196基因多態(tài)性是健康人血清AFP水平的獨立遺傳決定因素。rs2464196多態(tài)性與血清AFP基因表達的確切調(diào)控機制有待于進一步研究。

HNF1B基因位于染色體17q12上，編碼一種包含3個結(jié)構(gòu)域的POU轉(zhuǎn)錄因子：二聚體結(jié)構(gòu)域、POU DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及反式激活結(jié)構(gòu)域[14]。HNF1B同源二聚體或與HNF1A組成的異源二聚體在脊椎動物早期的發(fā)育和存活過程中起著關(guān)鍵作用[15]。研究表明，在肝臟發(fā)育過程中HNF1B早于HNF1A產(chǎn)生，是AFP基因啟動子強有力的激活劑。在成年人中，HNF1B的高表達與血清AFP水平顯著相關(guān)。在原發(fā)漿液性上皮性卵巢癌中的研究顯示與rs4430796高度連鎖不平衡的rs757210與HNF1B啟動子的低甲基化有關(guān)，可導致HNF1B表達增加[16]。筆者的研究表明rs4430796與血清AFP水平無關(guān)。然而，應該注意的是，雖然rs4430796不同基因型間AFP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義，但是rs4430796-AA、AG和GG基因型的AFP水平呈上升趨勢。考慮到本研究中AA基型人群數(shù)量明顯少于GG型(70例 vs 491例)，因此rs4430796與血清AFP水平的相關(guān)性仍需增加樣本量來進一步驗證。

C/EBPA基因是位于染色體19q13.11上的無內(nèi)含子基因，通過與AFP基因啟動子和增強子的結(jié)合反式激活AFP基因表達[17]。直接點突變分析顯示，在缺乏增強子Ⅰ的情況下，AFP基因Ⅰb(C/EBP)和Ⅱ(核因子1或C/EBP)區(qū)域的突變會顯著降低AFP基因啟動子活性，而Vb(C/EBP)區(qū)域突變對AFP基因啟動子有輕微的抑制作用[9]。少量研究表明C/EBPA基因多態(tài)性(rs34529039)與卵巢癌相關(guān)[18]。但迄今為止，還沒有研究表明C/EBPA基因多態(tài)性是否與血清AFP水平相關(guān)。根據(jù)ExAC或1000 Genomes數(shù)據(jù)庫，rs34529039-A的最小等位基因頻率分別為0.2143/39和0.1328/665。但在筆者的研究結(jié)果中，中國健康成人rs34529039-A的最小等位基因頻率僅為0.007/1010。這表明該SNP位點的等位基因頻率在不同種族人群中差異有統(tǒng)計學意義。本研究由于A等位基因頻率太低，筆者無法得出明確的結(jié)論。

ZHX2位于15號染色體上，參與出生后AFP基因的表達調(diào)控。研究表明，ZHX2可能通過影響AFP基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄過程來控制成人肝臟中AFP基因的低表達水平，即ZHX2基因的表達產(chǎn)物是AFP基因表達的負性調(diào)控因子，但這種調(diào)控作用主要發(fā)生在正常肝臟中[5]。有研究報道ZHX2基因多態(tài)性(rs7844465)與內(nèi)膜中層厚度相關(guān)[19]。筆者的研究表明rs7844465與血清AFP水平無關(guān)。

本研究存在一定的局限性。首先，樣本量不夠大，未檢測到某些基因型，例如rs34529039-AA基因型，這可能導致統(tǒng)計效力的降低。因此，筆者的研究應被視為初步揭示血清AFP水平與HNF1A、HNF1B、C/EBPA和ZHX2基因多態(tài)性相關(guān)性的研究。其次，筆者的研究結(jié)果來自于中國漢族人群，需要進一步在不同種族中進一步研究。最后，筆者研究的是健康人群，考慮到約40%的HCC患者血清AFP水平不升高，還應在HCC患者中做進一步驗證。因此，還需要更大規(guī)模更深層次的綜合性研究來證實基因多態(tài)性與血清AFP水平的相關(guān)性。

綜上所述，本研究在中國漢族健康人群中發(fā)現(xiàn)HNF1A-rs2464196與血清AFP水平顯著相關(guān)，rs2464196-A等位基因攜帶者更傾向于表現(xiàn)為低水平AFP。而HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs4430796與血清AFP水平無顯著相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為AFP的遺傳決定因素提供了新的見解，并可能幫助進一步了解某些HCC患者中AFP水平不升高的潛在機制。