朱 萍 潘 景 張 帆 吳麗慧

注意缺陷多動(dòng)障礙(attention-deficit hyperactivity disorder，ADHD)是以注意力不集中、活動(dòng)過度、沖動(dòng)為特征的一種神經(jīng)行為障礙，并伴有認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)困難[1]。在全球兒童中的發(fā)生率約3%～5%，而60%～80%患兒的癥狀可持續(xù)至青少年或者成年，是兒童常見的神經(jīng)精神障礙之一。目前ADHD的發(fā)病機(jī)制與病因比較復(fù)雜，還尚不明確，但多數(shù)研究者認(rèn)為是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，同時(shí)也與大腦結(jié)構(gòu)與功能異常有關(guān)。ADHD的主要診斷依據(jù)美國精神病學(xué)會《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第5版(DSM-V)兒童ADHD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，即問卷調(diào)查的方式[1]。目前還沒有可靠的分子診斷標(biāo)記。

非編碼小RNA(microRNA, miRNA)通常源于1個(gè)大小約為1000bp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)，pri-miRNA分子在細(xì)胞中經(jīng)過雙鏈RNA特異性RNsae Ⅲ-drosha的作用下形成70～100nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體microRNA (pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportion-5的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，被另一個(gè)雙鏈RNA特異性RNsae Ⅲ-dicer識別，進(jìn)一步切割成為成熟miRNA。miRNA與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、人類遺傳性疾病甚至神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA含量特別豐富，其功能涉及神經(jīng)發(fā)育、分化、退行性變、凋亡等，同時(shí)也涉及記憶、精神發(fā)育遲緩等方面，但miRNA在神經(jīng)發(fā)育與活動(dòng)中的作用還存在廣泛的未知性[2,3]。研究報(bào)道帕金森綜合征患者的血清中miR-133b，腦皮質(zhì)組織中miR-205,表達(dá)量是顯著降低的；重度抑郁患者外周血中miR-132表達(dá)量增加，并且是通過結(jié)合在甲基-CpG結(jié)合蛋白(MeCP2)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的mRNA上的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，使MeCP2、BDNF表達(dá)下降，從而影響重度抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展[4～6]。因此筆者猜測，和正常兒童比較，ADHD患兒外周循環(huán)中是否可能存在一組miRNA表達(dá)量有顯著性差異，這些改變的miRNA可能成為ADHD潛在的診斷標(biāo)記，故本研究采用miRNA 芯片技術(shù)篩選出在ADHD患兒外周血清中差異表達(dá)的miRNA。

對象與方法

1.研究對象：實(shí)驗(yàn)樣本來自2015年10月～2016年2月在筆者醫(yī)院就診的ADHD患兒20例，符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的健康兒童60例。按照年齡和性別配對形成ADHD兒童∶正常兒童=1∶3的病例組20對。(1)病例組(ADHD)兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：①6～18歲兒童；②根據(jù)美國精神病學(xué)會《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第5版(DSM-V)兒童ADHD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除精神發(fā)育遲緩、品行障礙、情緒障礙、學(xué)習(xí)障礙及各種精神疾病等；③通過詳細(xì)的體格檢查、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神狀況檢查與相關(guān)實(shí)驗(yàn)室輔助檢查，排除軀體疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾??；④智商>70；⑤班主任綜合評定認(rèn)為在語文和數(shù)學(xué)方面無明顯的學(xué)習(xí)困難，期末考試成績在全班平均成績減1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上；⑥近2周內(nèi)未使用精神藥物治療。(2)對照組(非ADHD組)兒童的納入標(biāo)準(zhǔn)： 通過詳細(xì)的體格檢查、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神狀況檢查與相關(guān)實(shí)驗(yàn)室輔助檢查，排除精神發(fā)育遲緩、品行障礙、情緒障礙、學(xué)習(xí)障礙及各種精神疾病，排除軀體疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的健康兒童。該研究遵守《赫爾辛基宣言》，通過了筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。該研究的目的、方法、可能后果及健康保證均向兒童監(jiān)護(hù)人交待清楚，所有監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

2.標(biāo)本收集：ADHD兒童和正常兒童采血前休息20～30min，通過肘靜脈采血4ml，室溫靜止1h，4℃ 10000r/min，離心10min，用取樣器將上清液(血清)吸取到無菌試管，血清標(biāo)本儲存于-80℃冰箱。

3.microRNA 芯片篩選差異表達(dá)microRNA：所有樣本都用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化公司)抽提總RNA，使用美國Agilent公司人miRNA芯片V21.0(agilent human miRNA microarray V21.0)測試各組microRNA的表達(dá)量，該微陣列取自miRBase 21版數(shù)據(jù)庫，包含2549條人類miRNA的探針。每一張載玻片上包含8個(gè)單獨(dú)的微陣列，每個(gè)具有1900個(gè)功能。陣列包括48個(gè)陰性對照，用于估計(jì)熒光背景和背景差異，每個(gè)微陣列的樣品量為100ng，用Cy3標(biāo)記后，每張載玻片經(jīng) XDR Scan (PMT100，PMT5)掃描得到信號。打開agilent scan control software掃描芯片獲得miRNA的信號圖像，用agilent feature extraction(AFE) software version 10.7.1.1分析可以得到所有的芯片和miRNA信號值。這些信號經(jīng)消除背景后登陸SBC analysis system(http：//sas.ebioservice.com)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。選擇hsa-miR-1273g-3p為內(nèi)參，原因?yàn)椋僭谒袠颖緝?nèi)均有檢出；②標(biāo)準(zhǔn)差(SD)較小，在樣本間變化幅度??；③平均信號值較高，一般認(rèn)為>30的信號值(log2后約為>5)相對更可靠，因此選用該內(nèi)參進(jìn)行校正。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)驗(yàn)證:(1)引物設(shè)計(jì)：對改變量>2倍的miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)引物(引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，miR-30d-5p反轉(zhuǎn)錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCA-3′，檢測引物:5′-GTTGTTGTAAACATCC-3′； miR-4655-3p反轉(zhuǎn)錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCCG-G-3′，檢測引物:5′-TGTTGACCCTCGTCA-3′； miR-7641發(fā)轉(zhuǎn)錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAG-3′，檢測引物:5′-CTCGTTTGATCTCGG-3′；內(nèi)參miR-1273g-3p反轉(zhuǎn)錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCAG-GC-3′，檢測引物:5′-TCTAGTAACCACTGCACTC-3′，這4個(gè)miRNA在進(jìn)行PCR檢測時(shí)均用miR-223a作為反向互補(bǔ)鏈5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)。(2)RT：將抽提的血清總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV，日本TaKaRa公司)獲得cDNA. RT體系及條件為：先加樣Ⅰ體系(RNA 5μl，無菌水5μl，反轉(zhuǎn)錄引物1μl，內(nèi)參引物1μl)混勻后，反應(yīng)條件為70℃，10min,冰上5min；再加樣Ⅱ體系(5×RT buffer 4μl，10mol/L dNTP 1μl，無菌水2μl，M-MLV 1μl)混勻后，反應(yīng)條件為30℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min。(3)定量PCR: cDNA通過探針法實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR過程，最后用2-ΔΔCt法對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量。定量PCR體系及條件：2×Taqman Mix(CW0932S，康為世紀(jì))5μl，引物(40μmol/L)0.0625μl+0.0626μl，通用探針0.125μl，無菌水3.25μl，cDNA1.5μl，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s,60℃ 1min。50個(gè)循環(huán)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：芯片結(jié)果選擇內(nèi)參miR1273g-3p在所有樣本內(nèi)的中位值為基準(zhǔn)，將所有信號值減去該值。把對照組3個(gè)信號值取平均值后與ADHD患兒組進(jìn)行配對T檢驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果也采用配對T檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.microRNA 芯片初篩結(jié)果:同對照組60例健康兒童比較，在年齡相仿、性別一致的情況下，ADHD患兒血清中miR-30d-5p、miR-19b-3p，miR-6085、miR-19b-3p、miR-6749-5p、miR-6826-5p、miR-3960等61個(gè)microRNA的表達(dá)量在20例ADHD患兒中均有改變(表1)。其中改變量>2倍即fold change<0.5的是 miR-30d-5p， miR-4655-3p和miR-7641，表1中前3個(gè)，這3個(gè)miRNA在各樣本中的信號值(圖1)，上方文本為樣本編號，左側(cè)文本為microRNA(探針)編號，每一行代表1個(gè)基因(探針)，每一列表示1個(gè)樣本。顏色越紅代表miRNA在對應(yīng)樣本中的表達(dá)量越高，顏色越藍(lán)代表miRNA在對應(yīng)樣本中的表達(dá)量越低。

表1 ADHD相關(guān)的外周循環(huán)microRNA芯片篩選

圖1 miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641熱圖

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：將實(shí)驗(yàn)組(20例ADHD患兒)和對照組(60例健康兒童)的芯片結(jié)果表達(dá)量改變>2倍的miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在上述80例樣本中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，和對照組比較，miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在ADHD患兒外周血清中相對表達(dá)量降低(P=0.000)，與芯片篩選出的miRNA在ADHD中的表達(dá)趨勢一致(圖2)。

圖2 被篩選的miRNA在ADHD中的表達(dá)趨勢A.miRNA-30d-5p的相對表達(dá)量;B.miRNA-4655-3p的相對表達(dá)量;C.miRNA-7641的相對表達(dá)量

討 論

ADHD是兒童最常見的神經(jīng)精神障礙之一，主要表現(xiàn)為注意力不集中、多動(dòng)和沖動(dòng)，可分為注意力缺陷型、多動(dòng)/沖動(dòng)型和混合型，發(fā)病可延續(xù)到成年。美國兒科學(xué)會(American Academy of Pediatrics，AAP)2011年版ADHD指南指出，初級保健醫(yī)生應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到ADHD是一種慢性狀態(tài)，有著特殊的保健需要，若沒有維持長期治療，將會造成很大影響。其原因在于其有發(fā)展為破壞和過度冒險(xiǎn)行為，品行障礙，學(xué)習(xí)困難，情感問題的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而這些非核心癥狀將影響到兒童各個(gè)方面如學(xué)業(yè)成就、成長及生活質(zhì)量，給自身、學(xué)校、家庭和社會帶來極大負(fù)面影響[7]。迄今為止，ADHD的發(fā)病機(jī)制和病因未能完全清楚，大多數(shù)研究者認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多巴胺能、5-羥色胺能(5-HT)、去甲腎上腺素能的異常表達(dá)是ADHD的主要發(fā)病機(jī)制，而ADHD的主要診斷也是依據(jù)量表的形式，無分子診斷標(biāo)記[8～10]。

miRNA參與控制許多細(xì)胞/分子過程，如細(xì)胞凋亡、增殖和分化[11, 12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量特別豐富，其功能涉及神經(jīng)發(fā)育、分化、退行性變、凋亡等，同時(shí)也涉及記憶、精神發(fā)育遲緩等方面。本課題組首先利用ADHD大鼠模型SHR和正常對照模型Wistar Kyoto(WKY)大鼠比較，測得SHR的腦前額區(qū)(PFC)存在半乳凝素3(Galectin-3)及miR-let-7d的表達(dá)異常，并且發(fā)現(xiàn)miR-let-7d直接作用于Galectin-3的3′UTR從而負(fù)性調(diào)控Galectin-3的表達(dá)，同時(shí)Galectin-3的降低能抑制TH的表達(dá)，而TH是多巴胺代謝過程的關(guān)鍵酶[13]。為此筆者進(jìn)一步收集了35例ADHD患兒和35例門診體檢兒童，檢測到血清miR-let-7d的水平在ADHD組明顯高于對照組；在所收集到的ADHD患兒中，混合型占60%之多，因此推測miR-let-7d的高表達(dá)在混合型可能更加突出[14]。筆者還利用ADHD大鼠模型發(fā)現(xiàn)了和對照組WKY大鼠比較，SHR的前額皮質(zhì)區(qū)域的miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494表達(dá)顯著下降，經(jīng)過啟動(dòng)子序列分析和活性測定，確定了糖皮質(zhì)激素受體(Nr3c1)能夠使miR-34c *、miR-138-1、miR-296和miR-494基因的啟動(dòng)子活性及其轉(zhuǎn)錄得到抑制。同時(shí)測得在SHR的PFC中，Nr3c1表達(dá)異常升高。另一方面，筆者還通過熒光素酶報(bào)告得到miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494能結(jié)合在轉(zhuǎn)錄因子Bhlhb2(Bhlhe40)信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區(qū)上，從而抑制了Bhlhb2基因的表達(dá)。同樣地，Bhlhb2表達(dá)在ADHD模型SHR的PFC中也顯著高于對照。

為了進(jìn)一步觀察Bhlhb2在SHR體內(nèi)的作用，與對照組比較，敲除Bhlhb2基因能顯著改善SHR的活動(dòng)過度[15]。這些研究結(jié)果表明，Nr3c1-Bhlhb2軸失調(diào)參與了注意力缺陷和多動(dòng)癥的發(fā)展。結(jié)合本課題之前研究，認(rèn)為存在一組miRNA在ADHD上是有表達(dá)差異的，筆者想從ADHD患兒獲得直接的證據(jù)。故本研究通過基因芯片技術(shù)，在年齡和性別一樣的條件下，ADHD患兒外周血清中有61個(gè)miRNA較正常兒童降低，取fold change>2倍的miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，趨勢同芯片結(jié)果一致。但是這些差異miRNA與ADHD之間的相互作用還有待進(jìn)一步研究，有研究報(bào)道m(xù)iR-30d-5p在阿爾茲海默癥患者外周血中表達(dá)量升高，并且與亨廷頓舞蹈病有關(guān)，目前還沒有研究miR-4655-3p與miR-7641在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的報(bào)道[16,17]。筆者猜測這些差異miRNA可能通過調(diào)控靶基因來影響ADHD的病情發(fā)展。

綜上所述，miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641在ADHD患者外周血清中降低明顯，因此認(rèn)為這3個(gè)miRNA有可能作為臨床診斷ADHD的指標(biāo)之一，但是由于本研究中樣本數(shù)量有限，后續(xù)實(shí)驗(yàn)筆者將擴(kuò)大樣本量，驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，以及差異miRNA是否會隨著ADHD病情好轉(zhuǎn)或者藥物治療后表達(dá)量改變，有待后續(xù)追蹤隨訪情況。同時(shí)筆者將著重于預(yù)測靶基因，查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析靶基因功能，探討miRNA靶基因與ADHD之間可能存在的潛在關(guān)系。