程秀琴 艾力根·阿不都熱依木 唐 亮

喉鱗狀細(xì)胞癌 (LSCC)是頭頸部常見腫瘤之一，在我國東北地區(qū)高發(fā)，且發(fā)生率逐年上升，但病因不明[1，2]。病因?qū)W上統(tǒng)計結(jié)果顯示其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、人類乳頭瘤病毒感染、喉咽反流及胃食管反流疾病等諸多因素有關(guān)，另外還與ras、c-myc、EFGR、PRAD、Int-2等癌基因和p53、p16、FHIT等抑癌基因有關(guān)[3～5]。目前其主要治療手段為手術(shù)切除配合放射治療、化學(xué)治療，隨著治療手段的進(jìn)步，喉癌患者術(shù)后生活質(zhì)量不斷改善，但近30年來喉癌術(shù)后患者5年生存率仍沒有明顯提高[6]。因而尋找與喉癌發(fā)生有關(guān)的新基因，對了解喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及臨床干預(yù)具有重要意義。

Hippo信號通路是一個涵蓋30多個組件復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，越來越多的調(diào)節(jié)因子逐漸被鑒定，最核心的部分包括一系列級聯(lián)激酶和轉(zhuǎn)錄共活化因子。以哺乳動物為例，Hippo核心成員包括Mst、Lats，相關(guān)輔因子WW45和Mob等激酶及轉(zhuǎn)錄共活化因子YAP/TAZ等。該通路上游的核心成員主要通過逐級磷酸化抑制下游轉(zhuǎn)錄共活化因子YAP/TAZ，減少其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和控制細(xì)胞數(shù)目[7,8]。TAZ是Hippo信號通路主要的下游效應(yīng)因子之一，影響增殖分化等相關(guān)基因的表達(dá)，屬于致癌基因，據(jù)報道其在多種人類癌癥中表達(dá)異常。但目前并未有TAZ在人喉癌組織中的相關(guān)報道。

本研究首次檢測了32例喉癌組織及癌旁組織中TAZ的表達(dá)，并證實了TAZ在喉癌Hep2細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，旨在發(fā)現(xiàn)與喉癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的新基因。

材料與方法

1.化學(xué)試劑:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；MTT粉購自美國Amresco公司；實時PCR引物及過表達(dá)載體均購自廣州銳博公司；鼠抗人TAZ、LATS1、E-cadherin、Vimentin、GAPDH、β-actin單克隆抗體購自美國CST公司。

2.細(xì)胞株及組織：Hep2細(xì)胞為人喉癌細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。32例原發(fā)性喉癌組織標(biāo)本來自2010年1月～2017年8月期間筆者醫(yī)院手術(shù)切除的喉癌根治術(shù)標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療處理，經(jīng)病理證實為喉鱗狀細(xì)胞癌?；颊吣挲g為43～75歲，取癌和癌旁<1cm范圍內(nèi)正常組織于-80℃凍存。

3.免疫組織化學(xué):將收集的患者組織樣本，用4%PFA固定后石蠟包埋切片，濕紙巾鋪于載玻片盒底部做成加濕盒備用：切片常規(guī)脫蠟至水，hydrogen peroxide block中孵育10min將以降低非特異性背景染色；緩沖液清洗后滴加一抗工作液37℃孵育2h；洗去一抗滴加一抗增強(qiáng)子(primary antibody enhancer)室溫下孵育20min；緩沖液清洗后滴加酶標(biāo)二抗室溫下孵育30min；洗去二抗，向1ml DAB+基質(zhì)(plus substrate)中滴加2滴 DAB+色原(plus chromogen)混勻后滴加到切片上，孵育10min；自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

4.MTT法檢測細(xì)胞增殖活性:細(xì)胞用MTT比色測定細(xì)胞增殖活性：將細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞104個/孔，24h后吸去上清液，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TAZ質(zhì)粒及對應(yīng)空載48h。分別在1、2、3天收集培養(yǎng)好的TAZ過表達(dá)細(xì)胞及對應(yīng)空載細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液接種于96孔板中，濃度為1×105/ml，每孔100μl，孵育24h后換液，每孔加入10μl的MTT，濃度為5mg/ml，4h后，通過酶標(biāo)儀檢測各孔495nm波長的吸光度(A)值。按以下公式計算細(xì)胞增殖率：增殖率(%)=(實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。

5.細(xì)胞集落形成實驗:將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞104個/孔，24h后吸去上清液，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TAZ質(zhì)粒及對應(yīng)空載48h。將培養(yǎng)好的TAZ過表達(dá)細(xì)胞及對應(yīng)空載細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液接種于平板中，在每60mm培養(yǎng)皿中置入1000個細(xì)胞，每隔3天更換培養(yǎng)基。7天后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況并拍照。

6.實時PCR檢測TAZ及EMT相關(guān)基因的 mRNA水平：將收集的患者組織樣本用TRIZOL法提取總RNA，用Thermo公司的Nanodrop 2000分光光度計測定RNA的濃度和純度，點樣量為1μl，通過儀器分析及計算機(jī)直接讀出濃度(ng/μl)，并根據(jù)A260/A280比值判斷純度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，按照實時PCR試劑盒說明書方法檢測樣本中TAZ的轉(zhuǎn)錄水平。引物序列詳見表1，每個樣本3個復(fù)孔，按兩步法PCR擴(kuò)增，條件為：步驟1:95℃ 30s；步驟2:95℃ 5s，60℃ 30s(40個循環(huán))；步驟3: Melt Curve(美國Bio-Rad公司，CFX96)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時PCR的擴(kuò)增曲線及溶解曲線是否滿足要求，儀器軟件中自動輸出Ct值，計算相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法，按照下列公式計算：△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(轉(zhuǎn)染YAP1細(xì)胞)-ΔCt(轉(zhuǎn)染空載細(xì)胞)。

7.Western blot法檢測TAZ、Hippo及EMT相關(guān)基因的蛋白表達(dá)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞105個/孔，24h后吸去上清液，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TAZ(LATS1)質(zhì)粒及對應(yīng)空載，48h后收集細(xì)胞提取蛋白。細(xì)胞用改良的RIPA緩沖液裂解(美國Sigma-Aldrich公司)，蛋白質(zhì)含量用Bradford reagent(美國Thermo Scientific公司)測量。所提取蛋白(50μg)在變性聚丙烯酰胺凝膠中分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(微孔)，以5%的脫脂牛奶封閉(印度HiMedia公司)。然后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)暗室顯影，凝膠成像儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)掃描紀(jì)錄，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行分析比較。

表1 RT-PCR引物序列

結(jié) 果

1.TAZ在喉癌組織中高表達(dá):收集32例患者喉癌組織及癌旁組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示喉癌組織中TAZ的表達(dá)明顯增加(圖1A)。分別提取32例患者喉癌組織及起癌旁組織樣本總RNA并反轉(zhuǎn)錄得cDNA，經(jīng)實時PCR分析發(fā)現(xiàn)癌組織中TAZ轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)(圖1B)。

圖1 TAZ在喉癌組織和癌旁組織的表達(dá)規(guī)律A.免疫組化結(jié)果；B.32例喉癌組織臨床樣本實時PCR結(jié)果

2.TAZ對人喉癌細(xì)胞系Hep2細(xì)胞增殖的影響:為進(jìn)一步探知TAZ對喉癌細(xì)胞的作用，筆者將TAZ基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉(zhuǎn)染到喉癌Hep2細(xì)胞中，Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果如圖2A所示，表明轉(zhuǎn)染成功。過表達(dá)TAZ細(xì)胞用MTT比色測定細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示TAZ過表達(dá)后Hep2細(xì)胞活力增加(圖2B)，同時細(xì)胞集落形成實驗也證實TAZ過表達(dá)后Hep2細(xì)胞增殖情況顯著增加(圖2C)。

圖2 TAZ促進(jìn)Hep2細(xì)胞增殖A.Hep2細(xì)胞TAZ過表達(dá)檢測；B、C.MTT分析及菌落形成實驗表明，過表達(dá)TAZ促進(jìn)Hep2細(xì)胞增殖；與Hep2-vector組比較，*P<0.05

3.TAZ對人喉癌細(xì)胞系Hep2細(xì)胞EMT過程的影響:為繼續(xù)探究TAZ促進(jìn)人喉癌細(xì)胞增殖的原因，筆者將TAZ基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉(zhuǎn)染到喉癌Hep2細(xì)胞中，檢測過表達(dá)TAZ后細(xì)胞EMT過程中相關(guān)指標(biāo)的變化。實時PCR結(jié)果顯示，Twsit、Slug、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著上調(diào)，而E-cadherin等上皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著下降(圖3A)，表明過表達(dá)TAZ后，喉癌細(xì)胞系Hep2出現(xiàn)上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，Western blot法檢測結(jié)果得到一致的結(jié)論(圖3B)。

圖3 TAZ激活Hep2細(xì)胞EMT過程A.RT-PCR分析;B.Western blot法檢測；與對照組比較，**P<0.05

4.TAZ影響Hep2細(xì)胞EMT過程與Hippo信號通路的關(guān)系:為進(jìn)一步探討TAZ促進(jìn)Hep2細(xì)胞EMT過程是否與Hippo信號通路有關(guān)，筆者將Hippo信號通路關(guān)鍵基因LATS1基因克隆到pcDNA3.1載體中，并轉(zhuǎn)染到喉癌Hep2-TAZ細(xì)胞中，檢測過表達(dá)LATS1激活Hippo通路后細(xì)胞EMT過程中相關(guān)指標(biāo)的變化。Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，過表達(dá)LATS1抑制TAZ表達(dá)，同時Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著降低，而E-cadherin等上皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著增加(圖4A)，表明過表達(dá)LATS1后，喉癌細(xì)胞系Hep2-TAZ上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化受到抑制，實時PCR結(jié)果得到一致的結(jié)論(圖4B)。

圖4 TAZ激活Hep2細(xì)胞EMT過程依賴Hippo信號A.實時PCR分析；B.Western blot法檢測；與對照組比較，*P<0.05

討 論

TAZ，一個由WWTR1基因編碼帶PDZ結(jié)合基序的共轉(zhuǎn)錄激活因子，因與14-3-3蛋白結(jié)合而被發(fā)現(xiàn)，屬于Hippo通路的另一個效應(yīng)基因，能與TEAD、RUNX2、Glis3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮不同功能，如細(xì)胞增殖，遷移及分化等，其功能異常導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，甚至誘發(fā)腫瘤[9，10]。此外，其亦可響應(yīng)許多胞外或胞內(nèi)的信號，包括細(xì)胞密度、機(jī)械壓力、能量狀態(tài)、缺氧等[11]。據(jù)報道，TAZ 作為一個致癌基因在多種人類癌癥中表達(dá)并扮演重要角色，如肝內(nèi)膽管癌，乳腺癌，橫紋肌肉瘤等，調(diào)控著癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、入侵、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及多能性[12～15]。但TAZ基因與喉癌的相關(guān)性及其在喉癌中的作用國內(nèi)外尚未見報道。

本研究中筆者發(fā)現(xiàn)較癌旁組織，喉癌組織中TAZ基因顯著高表達(dá)(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，喉癌組織中TAZ細(xì)胞核內(nèi)定位明顯增加，提示喉癌組織中過表達(dá)的TAZ可能通過入核與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游增殖等相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖等，從而參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TAZ，并轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞，使TAZ蛋白在Hep2細(xì)胞中表達(dá)增加，后續(xù)的細(xì)胞增殖能力分析顯示，TAZ基因表達(dá)增加能明顯增加Hep2細(xì)胞的增殖能力(圖2A)。此與筆者在喉癌組織中的表達(dá)檢測結(jié)果相符，證實TAZ基因能發(fā)揮致癌基因的作用，誘導(dǎo)Hep2腫瘤細(xì)胞增殖及喉癌的發(fā)展形成。進(jìn)一步研究其促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)現(xiàn)，TAZ促進(jìn)喉癌細(xì)胞系Hep2細(xì)胞的增殖可能是通過促進(jìn)EMT過程實現(xiàn)，實時PCR及Western blot法檢測結(jié)果顯示Twsit、Slug、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著上調(diào)，而E-cadherin等上皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)顯著下降，表明過表達(dá)TAZ后，喉癌細(xì)胞系Hep2出現(xiàn)上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變(圖3)。同時在該TAZ活化細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染LATS1表達(dá)載體以激活Hippo信號通路，并檢測EMT過程相關(guān)基因的變化，實時PCR及Western blot法檢測結(jié)果顯示過表達(dá)LATS1后，喉癌細(xì)胞系Hep2-TAZ上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變受到抑制，證明TAZ促進(jìn)喉癌細(xì)胞Hep2增殖的過程是依賴Hippo信號通路的(圖4)。

作為 Hippo 通路的一個效應(yīng)基因，TAZ與TEAD、RUNX2、MyoD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮功能，并受 Hippo 依賴或非依賴的方式調(diào)控[16]。TAZ與MyoD結(jié)合促進(jìn)肌細(xì)胞分化[17]。在非酒精性脂肪肝病中，TAZ肝細(xì)胞表達(dá)增加促進(jìn)炎癥、細(xì)胞死亡及纖維化[18，19]。除調(diào)控細(xì)胞組織發(fā)育外，TAZ在多種人類癌癥中也扮演非常重要的角色，調(diào)控著癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、入侵、間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及多能性，在多種人類癌癥如肝內(nèi)膽管癌，乳腺癌受到重視[20]。筆者的研究結(jié)果顯示，TAZ在喉癌組織中高表達(dá)并以Hippo依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)換過程，此結(jié)論為人類TAZ基因在癌癥中的重要性和廣泛性予以補(bǔ)充，同時為喉癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，喉癌的發(fā)生、發(fā)展與TAZ高表達(dá)相關(guān)，且TAZ高表達(dá)能促進(jìn)Hep2細(xì)胞增殖，對進(jìn)一步了解喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及臨床干預(yù)具有重要意義。